增殖细胞核抗原基因作为东海原甲藻生长指标的现场实验研究

论文摘要

对浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数的测定，是估算浮游藻类生产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测的基础。在实验室之前的研究工作中发现,增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）基因相对表达量可以作为指示其生长率变化的良好指标，并建立了中肋骨条藻和东海原甲藻PCNA基因相对表达量与其现场生长率之间的定量关系。为这两种赤潮的监测和预报研究奠定了基础。本研究在之前研究的基础上，着力于将该方法应用到对现场样品进行生长率的测定。分别从现场样品的采集方式、RNA提取方法、内参基因引物的特异性、定量PCR反应体系的优化等几个方面进行了实验。在对舟山外海东海原甲藻赤潮区的生长率现场测定中，对建立的PCNA相对表达量法进行了验证并应用于现场，为将该方法用于对赤潮的快速监测奠定了基础。主要研究结果如下：（1）从样品量、研磨方法、滤膜规格和提取试剂四个方面对RNA提取效率的影响进行条件优化实验。确定了最小样品量为2×106个细胞；在进行过滤时可选用孔径为10μm的醋酸纤维滤膜收集样品；对膜样处理时，既可将滤膜直接用液氮研磨，也可将样品从滤膜上刮取下后再用液氮研磨，具体磨样方式视样品情况而定；提取试剂以TRIZOL法为优。（2）通过将东海原甲藻细胞色素b（Cyt b）基因做序列比对，设计出符合实时荧光定量检测要求的引物，并以14种藻为参照藻，对所设计的引物的特异性进行了实验验证，表明其有较好的特异性。优化了反应体系，在20μL的反转录体系中，适宜的反转录RNA量为50ng200ng；PCR模板稀释10倍或向定量PCR反应体系中加入终浓度为0.2μg/μL的牛血清蛋白（BSA）均能有效地降低现场样品中抑制物的抑制作用，减小干扰。采用SYBR Green I染料法建立了检测东海原甲藻Cyt b基因的实时荧光定量PCR的标准曲线。得到的曲线方程为：Ct=-3.44lg[基因拷贝数]+36.53，其相关系数r=0.999。（3）将PCNA相对表达量法与现场培养法所得的生长率作比较，发现二者具有很好的一致性，都能反映现场水体中赤潮生物的原位生长情况。将该方法应用到2011年春季长江口外和舟山外海赤潮发生区的东海原甲藻生长率现场测定，发现多数站位生长率为负值，表明此次赤潮已经进入消亡阶段。本研究将PCNA相对表达量法应用于现场，对东海原甲藻赤潮进行生长率测定，很好地反映了赤潮的生长状况和发展趋势，为运用分子生物学技术对赤潮进行监控和预报奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 赤潮与东海原甲藻
• 1.1.1 赤潮
• 1.1.2 东海原甲藻
• 1.2 浮游藻生长率的研究
• 1.3 相对定量 PCR 和本研究相关基因
• 1.3.1 相对定量 PCR
• 1.3.2 内参基因——细胞色素 b（Cyt b）基因
• 1.3.3 目的基因——增殖细胞核抗原（PCNA）基因
• 第二章 东海原甲藻 mRNA 提取方法的优化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 器材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品量对 RNA 提取的影响
• 2.2.2 研磨方式对 RNA 提取的影响
• 2.2.3 滤膜规格对 RNA 提取的影响
• 2.2.4 提取试剂对 RNA 提取的影响
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 样品量对 RNA 提取的影响
• 2.3.2 研磨方式对 RNA 提取的影响
• 2.3.3 滤膜规格对 RNA 提取的影响
• 2.3.4 提取试剂对 RNA 提取的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 东海原甲藻 Cyt b 基因检测方法的建立
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 器材
• 3.1.3 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 RNA 反转录
• 3.2.2 东海原甲藻 Cyt b 基因质粒标准品的制备
• 3.2.3 东海原甲藻 Cyt b 基因引物特异性验证
• 3.2.4 东海原甲藻 Cyt b 基因 RFQ-PCR 标准曲线的建立
• 3.2.5 定量 PCR 反应体系的优化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 东海原甲藻 Cyt b 基因重组质粒验证
• 3.3.2 东海原甲藻 Cyt b 基因引物特异性验证
• 3.3.3 东海原甲藻 Cyt b 基因 RFQ-PCR 标准曲线的建立
• 3.3.4 定量 PCR 体系的优化
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 PCNA 相对表达量法估算生长率的现场验证
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 样品采集
• 4.1.2 器材及试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 藻种计数
• 4.2.2 RNA 提取
• 4.2.3 生长率测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 计数结果及用现场培养法测得的生长率
• 4.3.2 PCNA 相对表达量法测得的现场生长率
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 2011 年春季长江口外和舟山外海赤潮多发区东海原甲藻生长率的测定
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 样品采集
• 5.1.2 主要器材及试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 藻种计数
• 5.2.2 PCNA 相对表达量法估算现场生长率
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 微型浮游植物种类组成及细胞密度
• 5.3.2 东海原甲藻的现场生长率
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文