论文摘要
肿瘤转移始终是肿瘤防治工作中面临的难题,只有有效控制、阻断肿瘤转移才可能实现肿瘤的治愈。肿瘤在演进过程中,一些肿瘤细胞具有了侵袭和转移能力,而这种转移表型的获得在很大程度上是由于肿瘤细胞内基因发生异常改变引起的。目前,从分子水平揭示肿瘤转移的本质,研究肿瘤转移相关基因成为肿瘤转移研究的热点。抑制消减杂交和基因芯片技术的联合应用是克隆差异表型相关基因的有效手段。我们前期利用该技术从人肺巨细胞癌高低转移株PLA801C和PLA801D中筛选出79条与高转移表型相关的序列,其中3号序列与NM032717基因3’端100%同源,暂时命名其为mag-1（metastasis associated gene-1）。NM032717基因是一个日本研究小组在分析人肝母细胞瘤的基因表达谱和筛选与正常肝细胞的差异基因中发现的新基因,其编码蛋白的结构和功能未被深入研究。本文就mag-1与肿瘤细胞转移的相关性及其机制进行探讨。我们首先检测了作为SSH实验模型细胞株PLA801C、PLA801D的迁移能力及转移标志蛋白Id-1的表达水平,实验结果表明PLA801D的迁移能力及Id-1的表达水平均明显高于PLA801C,从而验证了我们的模型细胞株为1对高低转移肿瘤细胞。利用RT-PCR、免疫细胞化学染色以及Western-blot检测了mag-1在高低转移模型细胞中的表达水平,结果与抑制消减杂交的结果一致,即高转移株PLA801D的表达水平明显高于低转移株PLA801C的表达水平。此外我们还检测了另外3对高低转移肿瘤细胞中mag-1的表达水平,mag-1在MDA-MB-231与MCF-7, BE与PG间的表达也存在差异。从而提示mag-1可能是与肿瘤转移相关的基因。通过瞬时转染观察了mag-1正反义真核表达载体对mag-1表达水平的影响,发现正义表达载体能明显增加mag-1的表达水平,而反义表达载体对mag-1的表达水平没有明显的影响。在此基础上,将mag-1正义表达载体转染低转移肿瘤细胞PLA801C和MCF-7,并筛选出稳定转染克隆。利用筛选出的稳定转染细胞,分析了过表达mag-1对细胞生物学功能的影响。结果发现转染mag-1不影响细胞的形态和增殖,但能增强细胞的迁移、粘附及侵袭能力。鉴于反义真核表达载体不能有效抑制靶基因的表达,而RNAi是近年来广泛应用于基因沉默的技术手段。我们利用该技术进一步研究mag-1与肿瘤转移的关系。首先构建了针对mag-1的siRNA表达载体,将RNAi载体稳定转染高转移细胞株PLA801D,选取干涉效果最好的克隆细胞作为实验细胞,比较转染干涉载体与转染无关干涉载体细胞的迁移、粘附及侵袭能力。实验结果表明,干涉细胞内mag-1的表达能够降低肿瘤细胞的迁移、粘附及侵袭能力,结合前面过表达mag-1影响肿瘤细胞生物学行为的实验结果,我们认为mag-1与肿瘤转移相关,能够促进肿瘤细胞转移。为了进一步探讨mag-1促进肿瘤细胞转移发生的机制,我们观察了过表达mag-1对已知的与肿瘤转移相关分子的表达水平及细胞内游离Ca2+浓度的影响。结果发现增加mag-1的表达水平并没有引起PCNA、MMP-2、nm23H1、VEGF、MTA-1、Id-1、p53表达水平及游离Ca2+浓度的改变。我们在研究mag-1基因功能的同时,也在关注有关mag-1的研究进展。2006年9月复旦大学生命科学院余龙教授课题组报道克隆出1个溶血磷脂酸酰基转移酶（Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAAT）家族新成员—LPAAT- theta。经Blast比对,mag-1的基因序列与LPAAT-theta的基因序列100%同源。这就为我们从生化本质上认识mag-1提供了帮助。LPAAT的功能是催化LPA生成PA,PA是胞内重要的磷脂第二信使分子,最近研究表明PA可以直接活化mTOR信号通路。因此我们观察了过表达mag-1对mTOR信号通路的影响。结果发现,过表达mag-1能够引起mTOR的底物蛋白S6K1及4EBP-1磷酸化水平的上升,而mTOR的特异性抑制剂rapamycin能够抑制mag-1对S6K1、4EBP-1磷酸化促进作用;干涉细胞内mag-1的表达则能降低S6K1及4EBP-1磷酸化水平;mTOR活化的经典通路是PI3K/Akt/mTOR/S6K1（4EBP-1）,因此我们观察了mag-1对mTOR的上游分子Akt磷酸化水平的影响,结果发现mag-1表达水平的改变对mTOR的上游分子Akt磷酸化水平并没有影响。上述实验结果表明,mag-1对mTOR信号通路具有活化作用,而且可能作用于mTOR信号通路的下游。上述实验结果表明,mag-1能够促进肿瘤转移,同时mag-1能够活化mTOR信号通路,这就提示mag-1对肿瘤转移的促进作用是否是通过活化mTOR信号通路实现的?我们观察mTOR特异性抑制剂Rapamycin对细胞生物学功能的影响。结果发现,Rapamycin能明显抑制转染mag-1引起PLA801C的迁移、粘附、侵袭能力的增加。结论:mag-1可能与肿瘤的转移表型密切相关,活化mTOR信号通路可能在mag-1促进肿瘤转移中发挥重要作用。
论文目录
相关论文文献
- [1].MAG-1和mTOR生物学功能研究进展[J]. 现代肿瘤医学 2014(03)
- [2].mag-1基因与肿瘤细胞转移的相关性研究[J]. 军事医学科学院院刊 2008(04)
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