肿瘤抑制基因PTEN过表达对体外培养的人气道平滑肌细胞增殖的影响

论文摘要

一.研究背景气道重塑是支气管哮喘基本特征之一,将气道炎症和气道高反应性联系起来。气道重塑指的是哮喘中发生于气道壁的结构改变,这些改变包括上皮细胞的增生和化生,上皮下纤维化,肌细胞增生和血管发生。而气道平滑肌细胞（airwaysmooth muscle cell,ASMC）是气道重塑的主要结构成分之一。哮喘时ASMC生物学特性发生很大变化,包括增生,肥大,迁移等,不仅使支气管对刺激的收缩反应更强烈,加重气道高反应性,而且增殖的ASMC使气道壁增厚,导致基础气道阻力增加和不可逆性气流阻塞的发生。遗憾的是,当前尚无可以阻止或逆转气道重塑和其对肺功能影响的有效治疗。因此迫切需要深入了解气道重塑时ASMC的增殖和迁移等机制,寻找抑制其增殖和迁移等的靶点,为寻找新的阻止甚至逆转气道重塑的药物提供理论和实验依据。与张力蛋白和辅助蛋白同源,第10号染色体丢失的磷酸酶基因（phophataseand tensin homolog deleted on chromosone 10,PTEN）是近年来发现的一种新的抑癌基因,是至今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,对细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移和血管生长等许多生物学行为有重要影响。随着研究的深入人们也发现其在非肿瘤性疾病,如:心肌肥大,高血压动脉粥样硬化,支气管哮喘哮等疾病中也发挥重要的作用。已有的研究已经证实PTEN可以通过对PI3K,ERK和FAK等通路的抑制来抑制肿瘤细胞,心肌和血管平滑肌等细胞的增殖,而这些通路同时也是介导ASMC增殖,迁移等的主要信号传导通路,PTEN对ASMC的增殖等是否也有类似地影响,目前尚无相关的报道。我们推断PTEN的过表达对HASMC可能也具有类似的抑制增殖作用。二.研究目的通过携带野生型PTEN全长cDNA的质粒转染体外培养的人气道平滑肌细胞（Human Airway Smooth Muscle Cell,HASMC）,实现PTEN的过表达,以空质粒转染和正常组作为对照,初步研究PTEN的过表达对HASMC增殖和细胞周期进展的影响。三.材料和方法1、分离肺癌肺叶切除术患者切除的相对正常的肺组织中的小支气管,按照本实验室已经成熟的方法培养人气道平滑肌细胞,4～8代的气道平滑肌细胞用于实验。用抗平滑肌a—肌动蛋白单克隆抗体鉴定为人气道平滑肌细胞。2、携带野生型PTEN cDNA的质粒（p-WT-PTEN）和空载质粒（p-EGFP）转化入大肠埃希菌DH5a中扩增。氨苄青霉素筛选,挑选阳性克隆,摇菌,Omega公司无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒,双酶切,及基因测序鉴定正确后,大量提取质粒,-20℃保存备用。3、实验分组:将细胞分为3组:转染p-WT-PTEN质粒组（A组）、转染空载体p-EGFP组（B组）、正常对照组（C组）。参照Lipofectamin2000脂质体转染试剂盒步骤进行操作,倒置荧光显微镜观察转染效果。4、MTS/PMS微量比色法检测各组HASMC的增殖。5、各组细胞PI单染后流式细胞仪测定细胞周期分布。6、Trizol提取总RNA,RT-PCR检测各组细胞PTENmRNA的表达。7、免疫组化SP法检测转染后各组HASMC PTEN蛋白的表达并拍照。8、所有原始数据以均数±标准差表示,应用SPSS11.5软件进行One WayANOVA（LSD）统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。四.结果1、ASMC未汇合之前多呈梭形或多边形,内有1-2个细胞核,可向细胞密度低的方向伸出一至数个足突。细胞汇合后部分区域细胞束状排列,呈典型“峰谷”状。对平滑肌细胞特异的a-肌动蛋白进行免疫细胞化学染色,免疫反应阳性产物呈棕黄色。传至第4代,平滑肌纯度为95%。2、少量制备的质粒,经XbaⅠ和HindⅢ酶切后,琼脂糖凝胶电泳,可显示两条条带,分子量分别为5.4kb、1.3 kb,与pGZdXZ和插入的PTEN基因的大小一致。提取的质粒送北京诺赛公司测序,测序结果经BLAST与Genebank序列完全相符。3、倒置荧光显微镜下,见质粒成功转染ASMC,转染阳性细胞在荧光显微镜下发绿色荧光。4、MTS/PMS法检测质粒转染对HASMCs增殖的影响,结果显示p-WT-PTEN转染组细胞的吸光度（OD490值）显著低于p-EGFP转染组和对照组（P＜0.05）;而p-EGFP转染组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。5、流式细胞仪检测质粒转染对HASMCs细胞周期的影响,p-WT-PTEN转染组G0/G1期细胞的比例显著大于空载体转染组与未转染组,S期及G2/M期细胞的比例显著少于p-EGFP转染组与对照组（P＜0.05）,p-EGFP转染组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。6、RT-PCR同时扩增p-WT-PTEN转染组,p-EGFP转染组和对照组PTENmRNA,结果显示p-WT-PTEN转染组PTEN mRNA的表达显著比p-EGFP转染组及对照组PTEN mRNA的表达增加。7、转染48小时各组HASMC PTEN蛋白免疫组化结果显示,PTEN蛋白在p-WT-PTEN转染阳性HASMC胞浆和胞核均有明显表达,且胞核表达比胞浆多,而p-EGFP转染组和对照组仅见微弱的PTEN蛋白表达。五.结论1、PTEN在HASMC中具有与在其他细胞中类似的抑制增殖的作用,外源PTEN的表达能够抑制HASMC的增殖和细胞周期进展,G0/G1期细胞的比例增大,而S期及G2/M期细胞的比例减少。2、p-WT-PTEN成功转染体外培养地HASMC后,PTEN在mRNA和蛋白水平表达增加。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 不足与展望
• 参考文献
• 附录
• 1. BLAST结果
• 2. 英文缩略词表
• 研究生期间成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明