论文摘要
目的为了在整体水平研究甘丙肽的功能，构建了神经特异表达甘丙肽过表达载体，并进行显微注射以制作转基因小鼠。由于在正常生理过程中，甘丙肽表达水平比较低，只有在某些病态下甘丙肽表达才会有异常的变化，故制作转基因小鼠，以研究内源性释放的甘丙肽的功能及作用机制，为相关疾病提供新的治疗线索。方法首先提取C57BL/6J小鼠脑组织中总RNA和基因组DNA，分别以总RNA和DNA为模板，用RT-PCR技术获得甘丙肽的cDNA编码区，再用PCR技术获得甘丙肽5′非编码区和3′非编码区，然后用重叠延伸PCR技术连接上述片段，获得甘丙肽目的基因，将目的基因上游插入PDGFβ-链启动子，将重组质粒命名为PDGF-GAL；重组质粒PDGF-GAL经XbaⅠ、HindⅢ双酶切，将连接有启动子的甘丙肽基因片段回收纯化后，用显微注射法将甘丙肽基因注入受精卵的雄原核中，选取发育正常的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管壶腹部，待其产仔。结果甘丙肽目的基因经测序鉴定，与GenBank中甘丙肽的基因序列相同；重组质粒PDGF-GAL经酶切鉴定正确无误；对甘丙肽重组质粒进行转化扩增，质粒经回收、酶切及纯化后，用TE缓冲液稀释成3 ng/μL，注射入受精卵的原核中，移植后顺利怀孕。结论成功构建神经特异表达的甘丙肽转基因载体，酶切后得到用以显微注射的甘丙肽基因片段，并用显微注射法成功将甘丙肽重组片段注入到受精卵并怀胎，所用技术均正确无误。
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