陆地棉GhCYP1基因的分离及其耐盐耐病功能分析

论文摘要

棉花是我国最主要的经济作物之一,属中等耐盐植物。随着人们对纺织品的需求日趋提高,而土壤盐碱化又日趋严重,土壤中高浓度盐分成为制约棉花产量的重要因素。因此,如何开发和利用盐碱地成为保障棉花产量的主要措施之一,其中,分离鉴定耐盐关键基因,增强棉花的耐盐能力,对提高棉花对盐碱地的适应能力具有重要意义。植物亲环蛋白（Cyclophilins,CyPs）基因是一类被发现与植物发育调节有关,并且参与植物对多种生物和非生物逆境响应过程的功能基因。本论文研究在应用SSH-PCR技术筛选得到棉花耐盐相关基因EST序列基础上,分离克隆到棉花耐盐相关基因GhCYP1,并且对该基因的耐盐和耐病功能进行了分析研究,以期通过基因工程手段增强棉花的耐盐耐病能力,从而为进一步培育耐盐耐病转基因棉花及其育种提供种质资源。取得的主要研究结果如下:1.采用RACE技术,分离克隆到全长为801 bp,含编码序列（CDS）为522 bp的棉花耐盐相关基因GhCYP1,氨基酸序列比对分析得知,该基因与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、人（Homo sapiens）等亲环蛋白基因（CyPs）高度同源。2.利用半定量RT-PCR技术对该基因在棉花中的表达模式进行分析,得知该基因在棉花的叶、茎、根中均稳定表达,且在茎、根中的表达量高于叶中。3.利用农杆菌介导法将GhCYP1基因导入烟草和棉花中,通过盐胁迫处理发现:在150 mmol/L NaCl胁迫下,转基因烟草幼苗生长正常,而非转基因对照材料则受到严重的盐毒害;经过40 d的高温盐胁迫处理,非转基因棉花对照材料叶片几乎全部脱落,无法结籽,而转基因棉花叶片仅脱落少许,后期能收获到少量种子,本次实验共筛选到7份耐盐转基因棉花材料。4.对温室盆栽生长的非转基因烟草对照及过量表达GhCYP1基因的烟草叶片进行烟草野火病菌注射接种。通过统计接种不同天数后细菌在叶片中生长状况和观察烟草叶片受害程度两种方式来进行分析,结果表明较非转基因烟草对照而言,外源GhCYP1基因导入烟草可以抑制烟草野火病菌的生长,从而使植株表现出较轻病害症状,体现出强的耐病性。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 植物耐盐研究进展
• 1.2.1 盐胁迫对植物的危害
• 1.2.2 植物的耐盐机理
• 1.2.3 棉花耐盐研究进展
• 1.3 植物耐病性与烟草野火病菌致病性
• 1.4 亲环蛋白（Cyclophilins,CyPs）基因的研究进展
• 1.4.1 亲环蛋白（ Cyclophilins,CyPs）基因的研究起源
• 1.4.2 亲环蛋白（ Cyclophilins,CyPs）基因在动物免疫应答中的功能
• 1.4.3 亲环蛋白（ Cyclophilins,CyPs）基因在植物中的功能及研究现状
• 1.5 本论文的研究背景、目的及内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 工具酶和试剂盒
• 2.1.4 抗生素
• 2.1.5 质粒提取溶液配制
• 2.1.6 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 陆地棉GhCYP1 基因的克隆及其表达模式分析
• 2.2.2 过量表达陆地棉GhCYP1 基因烟草植株的获得
• 2.2.3 过量表达陆地棉GhCYP1 基因烟草的耐盐及接菌处理
• 2.2.4 过量表达GhCYP1 基因陆地棉植株的获得
• 2.2.5 过量表达GhCYP1 基因陆地棉植株的耐盐处理
• 第三章 结果与分析
• 3.1 陆地棉GhCYP1 基因全长的克隆及序列分析
• 3.1.1 陆地棉总RNA 的提取
• 3.1.2 陆地棉GhCYP1 基因全长序列的克隆及分析
• 3.2 陆地棉GhCYP1 基因的表达模式分析
• 3.3 植物表达载体的构建
• 3.4 陆地棉GhCYP1 基因烟草转化及功能分析
• 3.4.1 转陆地棉GhCYP1 基因烟草的获得及PCR 检测
• 3.4.2 转陆地棉GhCYP1 基因烟草的耐盐检测
• 3.4.3 转陆地棉GhCYP1 基因烟草的接菌分析
• 3.5 过量表达GhCYP1 基因陆地棉植株的获得及耐盐处理
• 3.5.1 过量表达GhCYP1 基因的陆地棉植株的获得
• 3.5.2 过量表达GhCYP1 基因的陆地棉植株的PCR 检测
• 3.5.3 过量表达GhCYP1 基因的陆地棉耐盐处理
• 第四章 讨论
• 4.1 关于RNA 的提取
• 4.2 关于PCR 扩增的问题
• 4.3 GhCYP1 基因的功能分析及后期的实验设想
• 参考文献
• 致谢
• 作者介绍
• 导师简介