论文摘要
本课题拟先在组织学水平,利用免疫组织化学技术研究NSE,P-gp,MRP1和Bcl-2在前列腺癌和良性前列腺增生症（BPH）手术标本中的表达。再在体外培养雄激素非依赖的前列腺癌DU145细胞,加入EGF和TGF-α诱导前列腺癌细胞发生NED,并通过光镜、电镜观察和检测NSE在mRNA和蛋白水平证实。然后用不同浓度梯度的顺铂作用于诱导发生NED的和未诱导的前列腺癌细胞,并进行对比研究。以期达到明确EGF和TGF-α是否可诱导NED;以及NED是否可以介导前列腺癌化疗耐药的目的。第一章前列腺癌和BPH组织中NSE、P-gp、MRP1和Bcl-2的表达目的:探讨NSE、P-gp、MRP1和Bcl-2在前列腺癌和BPH中的表达情况,并且研究这四种蛋白与前列腺癌分化程度的关系,从而为后续研究打下一定基础。材料和方法:10例BPH标本（55—75岁,平均61.2岁）和44例前列腺癌标本（61—77岁,平均64.3岁）取自中南大学湘雅医院泌尿外科2000—2007年的手术标本存档蜡块,标本系10%福尔马林固定,常规石蜡包埋。前列腺癌标本按照Gleason评分。前列腺癌患者术前均未接受内分泌治疗或其他治疗。标本4μm厚连续切片,分别做NSE、P-gp、MRP1和Bcl-2免疫组化染色。观察染色切片并计数10个具有代表性的高倍镜视野中阳性细胞的数量。阳性细胞数≤5%者为阴性表达,＞5%者为阳性表达。结果:P-gp在前列腺癌和BPH组织中均无表达:NSE、MRP1和Bcl-2均有表达。MRP1在两种组织中的表达差异有统计学意义（p＜0.01）,前列腺癌中的表达高于BPH;NSE和Bcl-2的表达无统计学意义（p＞0.05）。NSE、MRP1和Bcl-2的表达均随着前列腺癌分化程度的降低而表达增高。NSE列联系数（P）:0.458;MRP1列联系数（P）:0.472;Bcl-2列联系数（P）:0.375。将前列腺癌标本按有无NSE表达分为两组,MRP1和Bcl-2的表达有统计学差异（p＜0.05）,且在NSE表达阳性的前列腺癌组织中,两种蛋白的表达均高于表达阴性的组织。结论:（1）前列腺癌可表达NSE、MRP1和Bcl-2,且表达阳性率与肿瘤分化程度、Gleason评分相关,即分化差者表达更高。本研究未发现该肿瘤有P-gp阳性表达。（2）表达NSE的前列腺癌,有更高的MRP1和Bcl-2表达率,即该肿瘤的NED与其MDR和抗凋亡能力增强有关。（3）BPH可表达NSE、MRP1和Bcl-2,提示NED和MRP1、Bcl-2的表达参与了该疾病的发生发展。第二章雄激素非依赖前列腺癌细胞株DU145的NED诱导及P-gp、MRP1和Bcl-2变化检测目的:探讨DU145细胞在受EGF和TGF-α作用后是否会促进NED,并且检测P-gp、MRP1和Bcl-2的蛋白表达情况。材料和方法:将DU145细胞在不同条件下培养三天,每日光镜下观察细胞形态学变化。收集三天后的细胞,Western印迹杂交检测NSE、P-gp、MRP1和Bcl-2的表达情况,实时荧光半定量RT-PCR检测NSEmRNA的表达,电镜观察细胞内神经内分泌颗粒。结果:（1）光镜下观察:2%BCS不加生长因子的培养环境下,每天细胞形态无明显变化:加入10ng/ml EGF培养者较5ng/ml者形态学变化明显,以第一天发生NED的细胞数最多,每天逐渐增多,至第三天时,细胞形态变化更加明显,表现为胞体由原来的椭圆形向三角形、多边形转化,细胞伸出神经突出样突起;TGF-α诱导的细胞数目与EGF相似,但形态学变化不如EGF明显。加入AG825（EGFR的酪氨酸激酶抑制剂）的培养细胞,形态无明显变化。（2）Western印迹杂交结果:NSE的表达:在不加生长因子的2%BCS细胞中表达很弱,经EGF诱导后表达明显增强,且10ng/ml强于5ng/ml,而加入AG825拮抗EGF作用者,几乎无NSE表达。经TGF-α诱导后的效果与EGF相近。Bcl-2的表达:在不加生长因子的2%细胞有表达,经EGF或TGF-α诱导后表达明显增强,加入AG825拮抗EGF作用者表达较弱。P-gp的表达:各组细胞几乎无表达。MRP1的表达:在不加生长因子的2%细胞有表达,经EGF或TGF-α诱导后表达明显增强,加入AG825拮抗EGF和TGF-α作用者几乎无表达。（3）实时荧光半定量RT-PCR:相对于只加入2%BCS培养基的而言,加入EGF 10ng/ml和TGF-α10ng/ml的细胞的NSE mRNA分别增加10.7和10.1倍,提示NED程度增加。而加入AG825拮抗剂者则表达分别下降81%和77%。（4）电镜观察:在不加生长因子的2%BCS细胞中几乎无神经内分泌颗粒,经EGF和TGF-α诱导后,颗粒明显增多,而加入AG825拮抗者,几乎无神经内分泌颗粒。结论:（1）EGF和TGF-α可诱导前列腺癌DU145细胞发生NED,其诱导作用可被AG825所拮抗。（2）DU145细胞经诱导后表达NSE、MRP1和Bcl-2增强,提示抗凋亡性和耐药性增强。第三章NED诱导后DU145细胞对顺铂的耐药性研究目的:探讨NED诱导后的前列腺癌DU145细胞的顺铂耐药性变化。材料和方法:EGF和TGF-α诱导DU145细胞发生NED后,取对数生长期的细胞接种于96孔培养板上。每组均加入不同浓度的顺铂（0.1,0.5,1.5,10,50,100μg/ml）。培养48小时后行MTT比色法检测顺铂对各组DU145细胞增殖的影响。同样方法诱导后,取对数生长期的不同分组DU145细胞,加入浓度为5μg/ml的顺铂,作用48小时后收集各组细胞,经胰酶消化离心后制成细胞悬液,行流式细胞术检测凋亡细胞百分率并行细胞周期分析。结果:（1）顺铂可抑制DU145细胞的增殖。在各浓度点上,尤其在较高的顺铂浓度点上,经EGF 10ng/ml处理的细胞存活率大于EGF 5ng/ml,经TGF-α10ng/ml处理的细胞存活率大于TGF-α5ng/ml,相同浓度生长因子处理后的细胞,经相同浓度顺铂作用后细胞存活率相近。加入AG825拮抗生长因子作用者,细胞存活率明显降低。（2）浓度为5μg/ml的顺铂作用48小时后,经生长因子诱导过的细胞凋亡率低,且EGF 10ng/ml低于EGF 5ng/ml（p＜0.05）,TGF-α10ng/ml低于TGF-α5ng/ml（p＜0.05）;细胞周期也发生变化,G0/G1细胞数减少,S期和G2/M期细胞相应增多。结论:（1）EGF和TGF-α诱导前列腺癌DU145细胞发生NED后耐顺铂能力增强。（2）较高浓度的EGF或TGF-α诱导的细胞耐药性更强,两种生长因子相比,诱导的细胞耐药性相近。