醛固酮增加致密斑细胞超氧阴离子合成及相关机制研究

论文摘要

第一部分：醛固酮诱导致密斑细胞产生超氧阴离子目的：近年来,氧化应激在高血压等心血管疾病发生发展过程中的作用引起人们广泛关注。有研究报道心肌梗死和心衰病人体内醛固酮水平明显增高,会导致心脏炎症发生,该过程伴有心肌细胞氧化应激损伤和环氧合酶-2（Cyclooxygenase 2, COX-2）等大量炎性介质的释放。在脑和肠系膜动脉中,醛固酮能够通过释放一氧化氮（Nitric oxide, NO）介导血管舒张,同时还能够激活NAD（P）H氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase）使细胞内超氧阴离子（Superoxide, O2-）生成增多。在对体外培养的动脉上皮细胞系研究中也发现醛固酮通过刺激NAD（P）H （Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase）氧化酶增加02-的生成。另外,有人提出在临床治疗中及时纠正氧化／抗氧化失衡,可显著降低慢性肾衰病人并发心血管疾病的危险性。管球反馈（Tubuloglomerular glomerular feedback, TGF）是调节肾血流动力学、NaCl排泄和血压的重要机制。当流经肾致密斑血流量增加时,通过TGF反应可引起肾小球入球小动脉收缩,从而使肾小球率过滤降低。致密斑（Macula densa, MD）细胞释放一氧化氮可以调节TGF功能,而同样由MD合成的O2-则可使NO失活。我们在近期研究中发现NAD（P）H氧化酶NOX-2和NOX-4亚型在大鼠MD和MMDD1（Macula dense like cell line）细胞中都有表达。虽然醛固酮能诱导心脏和血管发生氧化或炎症过程,但其在MD细胞中的作用机制还尚不清楚。盐皮质激素受体（Mineralocorticoid receptor,MR）可被醛固酮激活,该受体在机体中分布广泛,其中包括肾远曲小管和集合管等,但在MD细胞中是否有表达却尚无报道。我们推测醛固酮可能通过激活MD细胞上MR而增加02-合成,此过程是由COX-2增加和NOX-2、NOX-4激活介导的。该研究有助于进一步了解醛固酮引起的氧化应激在高血压和高血压相关靶器官（心脏和肾脏等）损伤中的作用,为临床治疗提供新的干预靶点。材料方法实验细胞系本实验中所采用的MMDD1细胞是具有致密斑细胞特性的肾小管上皮细胞系。超氧阴离子（02-）检测我们使用lucigenin增强化学发光法检测MMDD1细胞中02-的量。操作步骤主要为,磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution, PBS）冲洗细胞两次,1 mL胰酶消化1 min,离心,去上清后,加入12 mL Krebs/Hepes缓冲液制备细胞悬浊液。然后分别进行以下五种处理：无处理组；醛固酮（10-8mol/L）组；醛固酮+COX-2阻断剂（NS398 10-6 mol/L）组；醛固酮+NAD（P）H阻断剂（apocynin 10-5 mol/L）组；醛固酮+COX-2+NAD（P）H阻断剂（醛固酮10-8 mol/L, NS398 10-6 mol/L和apocynin 10-5 mol/L）组。同时每组加入lucigenin （5×10-6 mol/L）37℃水浴30min后上机检测。PCR使用RNeasy Mini kit提取MMDD1细胞和小鼠心肌细胞tRNA。逆转录合成cDNA后,按以下步骤扩增COX-2、NOX-2、NOX-4和MR目的片段。1)1μL cDNA产物,1μL特异性引物,2μL 10×PCR缓冲液,1μL dNTP 2.5 mmol/L, 0.2μL Super Taq酶（5 U/μL）,NOX-2和NOX-4的PCR体系中加入1.2μL 50%甘油,最后加入去RNAase水使体系总体积达到20μL。2) PCR条件为：94℃3min,循环条件为94℃20 sec,59.4℃（COX-2）,56.6℃（NOX-2）,52.9℃（NOX-4） 30 sec, 72℃30 sec并循环40次。最后延长72℃8 min。3) MR受体的PCR体系为50μL其中包括1μL MMDD1 cDNA或是1μL小鼠心肌cDNA、MR引物和Taq多聚酶。PCR条件为,95℃2 min,循环条件为95℃40 sec,退火温度为58℃40sec,72℃55 sec并循环40次。最后延伸72℃8 min。电泳分离产物,观察拍照。β-actin作为内参。Real-time PCR醛固酮处理MMDD1细胞30 min后,使用RNeasy Micro kit （Qiagen）提取细胞tRNA,然后逆转录成cDNA。最后使用C1000TM Thermal Cycler real-time PCR仪参照说明书进行实验。检测COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA。β-actin作为内参。siRNA转染使用COX-2 siRNA （Ambion,美国）转染MMDD1细胞,以沉默COX-2基因。转染使采用siPORTTM Amine Transfection Agent （Ambion,美国）作为转染辅助物。Scrambled siRNA（Invitrogen,美国）作为阴性对照。实验流程为：在转染之前24 h,准备MMDD1细胞,将细胞分到6孔细胞培养盘中（2×105细胞／孔）,并且使用无抗生素的培养液培养。待细胞数为80%左右时,进行转染实验。转染时,将COX-2 siRNA 10 nmol/L和Amine Transfection Agent加入到培养细胞中共孵育18 h。然后,PBS冲洗细胞一次后更换正常细胞培养液,转染24 h后检测siRNA转染效率。Western blotRIPA缓冲液（加入蛋白酶抑制剂混合物）离心提取蛋白之后,使用Nanodrop分光光度计检测蛋白浓度,光波长度设定为280 nM。蛋白样本经电泳和转膜后,1%脱脂奶粉TTBS室温封闭一小时。根据研究目的,分别使用以下一抗,包括：1)MR受体一抗混合rMR 1-18 clone 1D5 （1:50）和MRN 365 clone2D6（1：100）。2)兔来源抗COX-2抗体（1：500）；兔来源抗NOX-2抗体（1：1000）；3)兔来源抗NOX-4抗体（HRP）（1：1000）；4)小鼠来源抗GAPDH抗体（1：5000）,在4℃孵育过夜。然后TTBS多次冲洗,室温下辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）标记的二抗（1：10000）孵育1 h （NOX-4除外）,ECL显影。Western blot条带采用VersaDoc image analysis system （Bio-Rad）进行分析。GAPDH作为内参蛋白。统计分析我们采用了单因素方差分析（ANOVA）和post-hoc Fisher LSD检验对数据进行统计分析,所有数据均采用均数±标准误表示,以P<0.05为显著性差异界值。结果1. MMDD1细胞上存在MR受体。本实验从mRNA水平和蛋白水平证实MMDD1细胞上有盐皮质激素受体（MR）表达。2.醛固酮通过激活MMDD1细胞上MR受体产生超氧阴离子O2-。醛固酮（10-8mol/L）处理细胞30 min后,O2-生成量从1260.9±50.9 RLU·s-1·105 cells-1增加到2463.5±145.2 RLU·s-1·105 cells-1。而细胞经MR受体拮抗剂eplerenone预孵育后再加入醛固酮,结果显示eplerenone完全阻断醛固酮诱发MMDD1细胞增多超氧阴离子02-的效果,02-生成量为1264.4±50.0 RLU·s-1·105 cells-1。3. RT-PCR结果显示MMDD1细胞上有COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA表达。4.醛固酮增加MMDD1细胞中COX-2、NOX-2和NOX-4蛋白表达。平行比较不同浓度醛固酮（10-9 mol/L和10-8 mol/L）对MMDD1细胞中COX-2、NOX-2和NOX-4蛋白表达量影响,发现10-8mol/L浓度的醛固酮,蛋白上调作用最为显著。醛固酮（10-8mol/L）处理细胞30 min后,MMDD1细胞中COX-2、NOX-2和NOX-4蛋白表达明显增多,其增加量分别为对照组的1.78±0.05倍、2.31±0.07倍和2.33±0.14倍。5.醛固酮通过COX-2、NOX-2和NOX-4影响MMDD1细胞超氧阴离子O2-生成。我们在观察不同阻断剂对醛固酮引起MMDD1细胞02-合成增多的影响中发现,NS-398 （10-6 mol/L） （COX-2阻断剂）,apocynin （10-5 mol/L） （NAD（P）H氧化酶阻断剂）或是同时加入NS-398 （10-6 mol/L）和apocynin （10-5 mol/L）预处理细胞都能够完全阻断醛固酮刺激MMDD1细胞内02-生成增多的作用。6.siRNA对MMDD1细胞中COX-2表达的影响。COX-2 siRNA显著降低MMDD1细胞中COX-2 mRNA表达。Scrambled siRNA对COX-2 mRNA则无明显作用。COX-2 siRNA对NOX-2 mRNA和NOX-4 mRNA表达无影响。以上结果表明该COX-2 siRNA对MMDD1细胞中COX-2沉默作用具有特异性和高效性。7.COX-2 siRNA对醛固酮诱导MMDD1细胞超氧阴离子O2-合成增多的影响。使用醛固酮（10-8 mol/L）刺激MMDD1细胞30 min,细胞中COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA表达明显增多。而使用COX-2 siRNA选择性沉默COX-2后,再用醛固酮刺激MMDD1细胞,结果显示醛固酮增加COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA水平的作用被阻断。为进一步验证COX-2在醛固酮诱导细胞产生超氧阴离子O2-过程中的作用,我们使用COX-2 siRNA预处理MMDD1细胞后,再检测其中超氧阴离子O2-水平。结果显示,醛固酮刺激MMDD1细胞内超氧阴离子O2-释放增多,而COX-2 siRNA预处理细胞则逆转醛固酮该效果。结论在MMDD1细胞中,醛固酮作用于MR受体,刺激细胞内COX-2表达增多,激活NAD（P）H氧化酶亚基NOX-2和NOX-4,从而引起细胞合成超氧阴离子O2-增加。第二部分：PKCa在醛固酮诱导致密斑细胞产生超氧阴离子中的作用目的醛固酮能激活结肠和肾小管（远端小管、收集小管和集合管等）上皮细胞上盐皮质激素受体（Mineralocorticoid receptors, MR）,引起电解液流量增加；它还能诱导心脏炎症和心肌氧化应激的发生。在论文第一部分我们主要阐述了醛固酮通过激活COX-2和NAD（P）H氧化酶导致MMDD1细胞生成O2-产物增多。但醛固酮该促氧化作用由何种细胞信号通路传导尚不清楚。蛋白激酶C （Protein kinase C, PKC）是介导细胞对类固醇类激素发生快速反应的一种信号转导蛋白。有研究报道醛固酮能增加肾皮质集合管细胞中的钠离子转运,该作用是经由PKCa信号通路介导。因此,我们推测PKCa可能参与了醛固酮通过刺激NOX-2和NOX-4导致MD细胞中的O2-产物增加的促氧化作用,并在本次研究中对该假设进行验证。材料方法同第一部分。结果1. NAD（P）H氧化酶抑制剂阻断醛固酮刺激MMDD1细胞产生O2-的作用。醛固酮（10-8 mol/L）刺激MMDD1细胞30 min后,O2-生成量明显增多,从1293±106 RLU·s·-1·105 cells-1升高到2349±222 RLU·s-1·105 cells-1。同时加入醛固酮和NAD（P）H氧化酶抑制剂apocynin处理MMDD1细胞30 min,醛固酮刺激MMDD1细胞合成O2-增多的效果被阻断。2.PKC抑制剂减弱醛固酮对MMDD1细胞促氧化作用。醛固酮（10-8mol/L）处理MMDD1细胞30 min后,O2-生成量从1184±54 RLU·s-1·105 cells-1增加到1982±138 RLU·s-1·105 cells-1。同时加入醛固酮和PKC抑制剂CC （Chelerythrine chloride）刺激MMDD1细胞30 min,醛固酮诱导MMDD1细胞O2-合成增多的效果明显减弱,表明PKC抑制剂阻断醛固酮促氧化作用。3. PKCα特异性抑制剂减弱醛固酮促氧化作用。为验证PKC亚型是否参与醛固酮促氧化作用,我们在实验中使用PKCα特异性抑制剂Go6976 （Go）.醛固酮（10-8 mol/L）明显增加MMDD1细胞合成O2-的作用。而同时加入醛固酮和Go6976 （Go）处理细胞30 min后,醛固酮诱导MMDD1细胞O2-合成增多的效果被阻断,表明PKCa参与醛固酮该促氧化作用。4. PKCαsiRNA阻断醛固酮对MMDD1细胞促氧化作用。为进一步证实PKCα在醛固酮促氧化途径中的作用。我们在实验中使用PKCαsiRNA,经验证PKCαsiRNA能有效沉默PKCαmRNA。醛固酮（10-8 mol/L）刺激后明显增加MMDD1细胞合成O2-量,而使用PKCαsiRNA预处理细胞18h则逆转醛固酮该诱导作用。5. PKCαsiRNA阻断醛固酮诱导的MMDD1细胞中NOX-2和NOX-4表达上调的作用。醛固酮（10-8 mol/L）刺激30 min后使MMDD1细胞内NOX-2和NOX-4蛋白表达明显上调,而使用PKCαsiRNA预处理则阻断醛固酮该诱导作用。该结果表明醛固酮刺激MMDD1细胞内NOX-2和NOX-4蛋白表达增加是通过PKCα通路介导。结论醛固酮诱导MMDD1细胞O2-产物生成增多的作用是由PKCα- NAD（P）H氧化酶途径介导的。MD细胞中O2-和NO浓度平衡在维持正常肾脏TGF中起到重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 附表
• 第二部分
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文
• 英文论文全文一
• 英文论文全文二
• 学位论文评阅及答辩情况表