蚊抗药性相关新基因NYD-Ch和NYD-Tr的初步功能研究

论文摘要

【目的】研究抗药性相关糜蛋白酶基因（NYD-Ch）和胰蛋白酶基因（NYD-Tr）与抗药性之间的关系。 【材料和方法】采用PCR方法,以淡色库蚊抗性品系cDNA文库为模板,扩增出抗性品系中高表达的NYD-Ch和NYD-Tr,经T/A克隆测序鉴定后,扩增纯化质粒,经酶切后纯化目的片段亚克隆到真核表达载体pIE1-3中,用PCR结合酶切鉴定,核酸测序验证。将上述重组表达载体分别单独转入和共转入蚊细胞,经筛选获得稳定转染的细胞系,RT-PCR和Western blotting鉴定目的基因的稳定表达,并用MTT和流式检测稳定表达的细胞对溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。 【结果】成功构建昆虫细胞表达载体并建立稳定转染细胞系,使目的基因在其中稳定表达。MTT结果显示:pIE1-3/NYD-Ch单独转染组,细胞存活率与对照组无显著性差异（p>0.05）;pIE1-3/NYD-Tr单独转染组,120μM溴氰菊酯浓度时,其细胞存活率较空载体组和未转染组分别增加38.20%（p<0.05）和9.66%（p>0.05）;pIE1-3/NYD-Ch和pIE1-3/NYD-Tr共转染组,120μM溴氰菊酯浓度时,其细胞存活率较空载体组和未转染组分别增加67.37%（p<0.01）和38.83%（p<0.001）;160μM药物浓度时,其细胞存活率较空载体组和未转染组分别增加48.83%（p<0.05）和24.26%（p<0.05）。 【结论】NYD-Ch和NYD-Tr在细胞对抗溴氰菊酯的毒性作用中有一定的保护力,提示NYD-Ch和NYD-Tr与抗药性相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 PCR反应模板
• 1.2 实验菌株与质粒
• 1.3 酶与实验试剂
• 1.4 细胞株
• 1.5 仪器设备
• 2 实验步骤
• 2.1 淡色库蚊抗药性相关基因克隆
• 2.1.1 引物设计
• 2.1.2 基因扩增
• 2.1.3 目的PCR产物的纯化回收
• 2.1.4 T／A克隆
• 2.2 真核表达载体pIE1-3／NYD-Ch和pIE1-3／NYD-Tr的构建和鉴定
• 2.2.1 质粒DNA的提取和纯化
• 2.2.2 重组T载体和质粒pIE1-3的酶切
• 2.2.3 目的基因与质粒载体的连接
• 2.2.4 pIE1-3／NYD-Ch和pIE1-3／NYD-Tr重组质粒的转化
• 2.2.5 pIE1-3／NYD-Ch和pIE1-3／NYD-Tr重组质粒的PCR鉴定
• 2.2.6 pIE1-3／NYD-Ch和pIE1-3／NYD-Tr重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 蚊细胞培养、基因转染和稳定转染细胞系的建立及鉴定
• 2.3.1 C6／36细胞培养
• 2.3.2 G418效应测定
• 2.3.3 基因转染及共转染
• 2.3.4 单克隆化及稳定转染细胞系的建立
• 2.3.5 pIE1-3／NYD-Ch和pIE1-3／NYD-Tr基因稳定转染细胞系的RT-PCR鉴定
• 2.3.6 pIE1-3／NYD-Ch和pIE1-3／NYD-Tr基因稳定转染细胞系的Western blotting鉴定
• 2.4 抗药性相关糜蛋白酶和胰蛋白酶基因的初步功能鉴定
• 2.4.1 溴化钾噻唑基四唑（MTT）显色法测定细胞相对存活率
• 2.4.2 流式细胞仪检测细胞调亡和细胞周期变化
• 结果
• 1 PCR和T／A克隆
• 2 昆虫细胞表达载体构建和鉴定
• 3 G418效应测定
• 4 pIE1-3／NYD-Ch和pIE1-3／NYD-Tr基因稳定转染细胞系的建立和表达鉴定
• 5 MTT法测细胞相对存活率
• 6 流式细胞仪检测结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 综述：昆虫抗药性的进化和遗传
• 论文独创性声明
• 论文使用授权声明