罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用

论文摘要

罗氏沼虾肌肉白浊病（Whitish muscle diseases of Macrobrachium rosenbergii）是近年来发生于罗氏沼虾苗种阶段的一种疾病,最早于九十年代发现于我国广东、广西一带,2000年在我国罗氏沼虾主要养殖省市出现暴发流行。病虾出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,又称为白体病、白尾病等,可在数天内发生大量死亡,死亡率可高达60%以上,严重时可达100%,成为罗氏沼虾养殖的主要威胁。 罗氏沼虾肌肉白浊病的病原是罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergiiNodavirus,MrNV）。罗氏沼虾诺达病毒粒子呈廿面体,无囊膜,大小为23～25nm,病毒核酸为单链RNA,由2个片段组成,RNA-l和RNA-2,分别为3.0kh和1.3kh。MrNV为首个从甲壳类中分离到的诺达病毒。 用提纯的MrNV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,得到12株能特异分泌抗MrNV的单克隆抗体（monoclonal antibody,Mab）的杂交瘤细胞。注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1:105～106。亚型鉴定结果表明,有6株单抗为IgGl型,4株单抗为IgG2a型,2株单抗为IgG2b型。12株单抗与对虾白斑综合症病毒（WSSV）和对虾桃拉综合症病毒（TSV）均无交叉反应。Western bolt分析表明,小鼠单抗2B5能与MrNV 43kD的外膜蛋白特异性结合。 制备MrNV兔抗血清,挑选效价高的腹水单抗2B5,建立了检测罗氏沼虾诺达病毒的三抗体夹心酶联免疫吸附测定法（three antibodies sandwich-ELISATAS-ELISA）,TAS-ELISA最适反应条件为:兔抗体以 lμg/mL包板,小鼠单抗2B5的工作浓度为1:50,000,该法检测MrNV的灵敏度达0.98ng。通过对病虾及疑似病虾的病毒检测,表明TAS-ELISA法比间接ELISA法、核酸电泳法有更高的阳性检出率和符合率;此外还摸索了降低病毒测定孵育温度和缩短孵育时间对病毒检测的影响,表明各步孵育温度和时间分别为25℃和20min对于白浊症状的病苗检测无明显影响,使得本法更加适合于生产实践。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 罗氏沼虾肌肉白浊病概况
• 1.流行情况
• 2.发病症状
• 3.病原研究
• 3.1 罗氏沼虾诺达病毒的鉴定
• 3.2 关于病原的相关报道
• 4.主要诊断技术
• 4.1 夹心酶联免疫检测法检测
• 4.2 逆转录聚合酶链式反应
• 4.3 斑点杂交
• 4.4 原位杂交法
• 第二章 诺达病毒科概况
• 1.α诺达病毒属
• 1.1 形态结构
• 1.2 复制机制
• 1.3 宿主范围
• 1.4 病理学
• 2.β诺达病毒属
• 3.罗氏沼虾诺达病毒
• 3.1 病毒粒子的性状
• 3.2 核酸测序结果
• 3.3 致病性
• 第三章 单克隆抗体技术在鱼类病毒研究中的应用
• 1.鱼类病毒单克隆抗体的种类
• 2 鱼类病毒单克隆抗体的应用
• 2.1 鱼类病毒病的诊断
• 2.2 病毒变异检查及毒株分型
• 2.3 病毒结构蛋白的定位及功能分析
• 2.4 疫苗研制中的应用
• 2.5 分析病毒在细胞表面的受体
• 2.6 病毒粒子与特异蛋白的纯化
• 第二部分 研究内容
• 前言
• 第一章 罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第二章 罗氏沼虾诺达病毒的多克隆抗体的制备及纯化
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第三章 罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测法的建立及应用研究
• 1.材料与方法
• 2.结果与分析
• 3.讨论
• 附录：常用试剂及配制
• 发表的学术论文和获奖情况
• 致谢