论文摘要
人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus HCMV）感染在人群中普遍存在，世界多数国家育龄妇女HCMV IgG抗体阳性率在76％以上，活动感染达6．3％，母婴垂直传播率高达35％。国内一些学者报道我国婴儿先天性HCMV感染发病率占1．2-12％不等。据此推测我国每年由HCMV先天感染所致伤残儿约4万名。HCMV先天感染引起的疾病或畸形主要包括：黄疸性肝炎、胆道闭锁、先天性巨结肠、小头畸形，以及智力低下等神经系统畸形等。至今为止，HCMV先天感染的致病机理尚不清楚。HCMV感染的不同临床表现和组织趋向性，可能与宿主的免疫状态有关，但病毒的自身结构，尤其是与病毒毒力、组织嗜性和与病毒逃避机体免疫的相关基因的差异，可能是决定HCMV先天感染病情轻重及引起何种器官受损的内在因素。1996年Cha等研究发现，在Toledo等临床低传代分离株中存在一个新的DNA区域，这个区域至少包括UL133-UL151共19个开放阅读框架ORFs（open readingframe），而在实验室株AD169中却不存在这一区域。作者推测，实验室株在细胞培养反复传代过程中出现了UL／b’区遗传信息的丢失和重排，导致HCMV毒力和致病性的明显减弱。因此，UL／b’区基因可能在HCMV致病过程中发挥重要作用。目前，关于H（?）MV UL／b’区基因的结构特点和表达产物功能的研究成为国际HCMV致病机理研究领域最活跃的部分。UL144基因是一个具有高度多态性的基因，编码一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一种疱疹病毒穿入介子（HveA或HveM）的类似分子，HveA是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员之一。研究发现，UL144基因分型可能与HCMV先天感染致病性有关。在这一区域中另一个具有高度多态性的是UL146基因。UL146和UL147基因编码产物一种α趋化因子，通过损伤外周血白细胞，特别是中性粒细胞影响宿主的免疫应答。UL146基因呈现多个基因型，但在个体内基因的变化高度保守。最新的研究结果表明UL141蛋白能够通过下调受累细胞上的NK细胞激活受体的配体CD155的表达，从而逃避NK细胞的杀伤作用。但目前尚无来自HCMV先天感染分离株的UL141基因序列分析的研究报道。Cha等对UL141基因的转录子结构进行了推测。研究发现在UL138与UL139之间的非编码区存在两个TATA序列，UL141与UL142之间的非编码区及μl142ORF内分别存在两个POLY（A）信号，而跨越UL139、UL140及UL141三个ORF的约2．5kb片断中无转录信号。说明这三个基因可能共用其中的转录信号，转录和表达可能存在某种联系。这种转录方式是否真的存在，这是否预示着这三个基因功能之间存在某种联系。在已经获得的人巨细胞病毒一些基因的mRNA结构中发现，人巨细胞病毒存在复杂的转录表达形式，并且基因mRNA结构的变化影响其功能的变化。UL57基因包含在3个不同转录子当中，这些转录子的5’末端分布在UL57基因起始密码上游800bp片段的不同位置，3’末端则跨越更大的范围，最大的一个转录子3’末端终止在UL51基因下游的PolyA信号处。UL57基因不同转录子受不同转录起始位点的调控。又如，UL4基因的mRNA5’端上游含有232个核苷酸的非编码序列，其中含有3个AUG起始信号，产生了一些小的阅读编码框。其中，第二个阅读编码框的编码产物能够抑制下游的UL4基因的表达。2000年，首次发现HCMV编码一个IL-10的类似物，根据mRNA结构分析发现，其基因起始位置与UL111A基因一致，而比UL111A基因提前终止。该基因包括3个外显子和2个内含子。可见，HCMV基因组的转录过程无论在转录子种类，mRNA拼接以及表达调控等各方面，都具有非常复杂的机制，与这些复杂机制对应的是复杂的mRNA结构。因此获得HCMV基因的转录子结构是揭示其致病机理的前提条件。本研究分别在基因的DNA水平探讨UL141基因在临床低传代分离株中的多态性及其与HCMV先天感染不同致病性之间的关系，并且从转录水平研究UL141基因能够转录出哪些转录子，进而获得转录子的一级结构。为进一步探讨HCMVUL／b’区其它基因乃至整个基因组其他基因的转录子结构，本研究构建了HCMV全长cDNA文库，为进一步探讨预测基因的表达潜力，研究HCMV转录子结构和基因表达调控奠定基础。材料和方法一、标本来源1、用于UL141基因多态性研究的31例标本包括29株低传代临床分离株和2例尿标本。29株分离株均来中国医科大学附属盛京医院1988-1993年住院患儿。2000年应用荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA，结果均为阳性。2例尿标本来自2003年中国医科大学附属盛京医院疑似HCMV先天感染住院患儿。另外，本研究中的序列与从Genbank上获得的其他8个临床分离株的UL141基因序列进行了序列的比较。2、用于UL141基因转录子结构研究和构建HCMV全长cDNA文库的分离株均来自2006至2007年中国医科大学附属盛京医院的住院患儿，年龄小于5个月。临床表现包括：巨细胞病毒性肝炎，多器官畸形、巨细胞病毒性肺炎等。应用荧光定量PCR（QPCR）方法检测患儿尿液HCMV-DNA，结果为阳性。二、实验方法（一）UL141基因多态性研究1、标本处理，提取DNA（1）临床分离株：取HCMV低传代分离株接种细胞的培养上清液与等量裂解液（华美生物工程公司）混合，煮沸15min，作为扩增模板。（2）尿标本：取1ml尿标本，15000rpm／min离心15min，弃上清，加DNA裂解液50μl，混匀，离心数秒。100℃煮沸10min，15000rpm／min离心5min，-70℃保存备用。2、PCR扩增（1）引物设计按照Toledo株序列（参考株，GenBank accessionmunberU33331），应用引物设计软件primer premier5．0设计用于扩增HCMV UL141片段的全序列引物、鉴定引物及分段PCR扩增分段引物（见表1）。引物也用于UL141基因测序。（2）PCR全序列扩增应用全序列引物及搭配引物（全序列及鉴定引物之一）和分段PCR引物扩增UL141基因全序列。制备反应体系如下：10×Buffer 5μl，Mgcl21．5mM，dNTPmixture 2．5μl（2．5mmol／L），上下游引物各1μl（33pmol／μ1），rTaq酶2U，模板3．5μl，用双蒸水补至总反应体积50μl。PCR循环条件见表1。表1，HCMV UL141基因PCR扩增引物和循环条件PCR产物经EB染色，1．5％琼脂糖凝胶电泳后，紫外检测仪下观察扩增结果。3、PCR产物纯化、回收及测序测序前所有扩增产物应用TakaRa公司的PCR Fragment Recovery kit切胶回收目的DNA片段，应用TakaRa公司的PCR Fragment Recovery kit试剂盒回收，以去除非特异产物带的干扰。PCR扩增阳性标本以UL141基因鉴定引物及分段引物测序，应用BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit试剂盒，采用美国“ABI3700全自动DNA测序仪通过正反两个方向分别对目的基因的正链及负链进行测序，以增加实验结果的可信性。测序由上海联合基因公司完成。4、序列分析和提交序列分析应用生物信息学软件DNAClub、BioEdit、Genedoc、DNASis、DNAStar等完成。序列提交用Sequin软件向GenBank提交整理后的HCMV UL141 ORF序列。（二）UL141基因转录子结构研究实验方法1、HCMV分离株分离培养（1）第2-15代人胚肺细胞传代培养人胚肺细胞分别接种到5ml玻璃试管、25 cm2和75cm2培养瓶中，分别加入含15％胎牛血清的1640培养液1ml、6ml和12ml，在37℃，CO2浓度培养，每72小时换液一次，待用。（2）HCMV传代培养①HCMV原代接种取新鲜晨尿1．8ml加入1％的双抗（青霉素和链霉素）0．2ml，1500rpm／min离心15分钟。取0．3ml上清加入到人胚肺细胞已经长成单层的细胞管内，37℃吸附30分钟。倒掉吸附后的尿液，加Hank’s液洗一次，加1ml含2％胎牛血清的1640培养液，置37℃温箱中旋转培养。②HCMV传代培养取-80℃冻存的毒株迅速融化后，分别取毒株0．2ml、0．5ml和1．0ml接种在人胚肺细胞已经长成单层的细胞管、25 cm2或75cm2培养瓶内，加含2％胎牛血清的1640培养液分别至1ml、6ml和12ml。置37℃温箱中培养，其中细胞管细胞旋转培养。每48-72小时换液一次。每周观察细胞病变出现2-3次，待细胞病变达到75％～100％时，用吸管将细胞吹下，-80℃冻存待用。（3）毒株收集将5代毒株接种在长满单层人胚肺细胞的25cm2培养瓶中，待细胞病变达到75％～100％时，加入1ml Trizol,将病变的细胞吹下，-80℃冻存，用于中RNA提取。2、分离株UL／b’区基因DNA测序由上海英俊公司完成。3、样品总RNA抽提根据GIBCO BRL公司的Trizol reagent操作说明书进行。分光光度计测量OD260和OD280值。total RNA电泳，电泳条件：1．5％琼脂糖凝胶，EB染色；100V、20min。4、3’RACE（1）引物序列①3’RACE Outer Primer：5’TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3’②3’RACE Inner Primer：5’CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 3’③UL141B 3’Outer Primer：5’CTGTTCTGGGTGCTGTTGAG3’④UL141B 3’Inner Primer：5’TCGGCTGATGAACGGACT3’⑤UL141 A 3’Outer Primer：5’CGC GAC TGA GCG TCC GGT TT 3′⑥UL141A 3’Inner Primer：5’CGT GGT AGT GAC CAC CGT GCG A 3′⑦逆转录引物：3′RACE Adaptor Primer（2）反转录反应反应体系：样品RNA1μl，3’RACE Adaptor（5μM）1μl，5×M-MLV Buffer 2μl，dNTP Mixture（10 mM each）1μl，RNase Inhibitor 10U，Reverse TranscriptaseM-MLV（RNase H-）50U／μl，RNase Free dH20 4．5μl，总体积10μl。反应条件：42℃，60min，70℃，15min。（3）Outer PCR反应反应体系：反转录反应液3μl，1×cDNA Dilution BufferⅡ7μl，UL141A3′RACE Outer Primer或UL141B 3’Outer Primer（10μM）2μl，3′RACE Outer Primer（10μM）2μl，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free)4μl，MgCl2（25mM）3μl，TaKaRaLA Taq 1．25U，dH2O 28．75μl，总体积50μl。反应条件：94℃3 min，94℃30 sec，55℃30 sec，20或30Cycles，72℃1 min 72℃10 min。PCR反应结束后，取5～10μ1的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。若没有得到目的扩增产物，可进行Inner PCR反应。（4）Inner PCR反应反应体系：1st PCR产物1μl，dNTP Mixture（2．5 mM each）8μl，10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+Free)5μl，MgCl2（25 mM）5μl，TaKaRa LA Taq 2．5 U，UL141A3′RACE Inner Primer或UL141B 3’Inner Primer（10μM）0．5μl，3′RACE Inner Primer（10μM）2μl，dH2O，26．5μl，总体积50μl。反应条件：94℃3min，94℃30sec，55℃30sec，30 Cycles，72℃1 min，72℃10min。3’RACE扩增设从未接种HCMV的人胚肺细胞提取的总RNA样品作为阴性对照，以排除来自人胚肺细胞mRNA的假阳性干扰。5、5’RACE（1）引物①5’RACE Outer Primer：5’CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 3’②5’RACE Inner Primer：5’CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3’③UL141B 5’Outer Primer：5’GCGTGAGAATTACGAAGC 3’④UL141B 5’Inner Primer：5’CGGTACTGGAGTCCGTTCAT3’⑤逆转录引物：Random 9 mers以上引物也用于PCR产物的测序。（2）去磷酸化处理使用Alkaline Phosphatase（CIAP）对Total RNA中裸露的5’磷酸基团进行去磷酸反应。得到CIAP-treated RNA。3、“去帽子”反应使用Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）去掉mRNA的5’帽子结构，保留一个磷酸基团。此反应液为CIAP／TAP-treated RNA。37℃反应1小时。（3）5’RACE Adaptor的连接酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，70％冷乙醇（RNase Free dH2O配制）漂洗，严格按照说明书进行。加入6μl的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到Ligated RNA。（4）反转录反应反转录体系10μl Ligated RNA 6μl，Random 9 mers（50 M）0．5μl，5×M-MLV Buffer 2μl，dNTP（10 mM each）1μl，RNase Inhibitor 10U，ReverseTranscriptase M-MLV（RNase H）50U。反应条件30℃10min，42℃1hr，70℃15min。（5）Otater PCR反应反应体系，反转录反应液3μl，1×cDNA Dilution BufferⅡ7μl，10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+Free)4μl，MgCl（25mM）3μl，TaKaRaLA Taq1．25U，UL141B5’Outer Primer（10μM）2μl，5′RACE Outer Primer（10μM）2μl dH2O 28．75μl，总体积50μl。PCR反应条件94℃3min，94℃30sec，55℃30sec 20 Cycles72℃1min，72℃10min。（6）Inner PCR反应反应体系，Outer PCR反应液1μl，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free)5μl，MgCl（25 mM）5μl，dNTP Mixture（2．5 mM each）8μl，TaKaRa LA Taq（5 U／μl）0．5μl，UL141B 5’Inner Primer10μM)2μl，5′RACE Inner Primer（10μM）2μl，dH2O 26．5μl，总体积50μl。PCR反应条件94℃3min，94℃30sec，55℃30sec 30 Cycles 72℃1 min 72℃10 min。为提高5’RACE的可信度，同时设从未接种HCMV的人胚肺细胞提取的总RNA样品作为阴性对照，以排除来自人胚肺细胞mRNA的假阳性干扰。每个实验样品同时进行TAP（-）和M-MLV（-）的负对照实验。TAP（-）即：RNA经去磷酸化反应后不进行TAP处理，直接进行5’RACE Adaptor的连接及后续实验，以验证RNA去磷酸化是否充分。如果充分，RT-PCR将不能扩增。如果不充分，会有RT-PCR扩增结果，但其扩增片段长度一般不同于目的片段。M-MLV（-）即：5’RACEAdaptor连接反应后进行RT反应时不添加M-MLV，以排除基因组DNA污染造成的假阳性结果。如果M-MLV（-）的负对照实验没有特异性扩增，说明5’RACE结果来源于mRNA。电泳检测PCR结果。电泳条件：1．5％琼脂糖凝胶，EB染色；100V，20min。紫外检测仪下观察结果。6、PCR产物的直接测序和克隆测序由上海英俊公司完成。（三）构建HCMV cDNA文库实验方法1、HCMV分离株分离培养（同前）2、样品total RNA抽提（同前）3、mRNA纯化采用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits试剂盒，严格按照说明书进行。分光光度计测量OD260和OD280值。4、cDNA合成、酶切及分级分离①cDNA第一链合成2μg样品RNA，1μl SMARTⅣOligonucleotide（10μM），1μl CDSⅢ／3′PCR Ptimer（10μM），加水至5μl。72℃温浴2 min，冰浴2 min。加入2．0μl 5XFirst-Strand Buffer（250mM Tris，30mM Mgcl2，375mM Kcl），1．0μl DTT（20 mM），1．0μl dNTP Mix（10 mM），1．0μl PowerScript Reverse Transcriptase，42℃温浴1 hr。将离心管置于冰上终止第一链合成。②LD PCR扩增cDNA100μl体系中含2μl cDNA第一链，10μl 10X Advantage 2 PCR Buffer，2μldNTP Mix（0．5M），2μl 5′PCR Primer（10μM），2μl CDSⅢ／3′PCR Primer（10μM），2μl 50X Advantage 2 Polymerase Mix，80μl去离子水。PCR：95℃1 min，95℃15 sec 68℃6 min，24个循环。③蛋白酶K消化向LD-PCR产物中加入2μl蛋白酶K（20μg／μl），45℃温浴20 min，加入50μl去离子水。酚氯仿抽提，乙醇沉淀，79μl去离子水溶解沉淀。④SfiⅠ消化反应体系100μl中含79μl cDNA，10μl 10X Sfi Buffer，10μl SfiⅠEnzyme（20unit／μl），1μl 100X BSA，充分混匀，50℃温浴2 hr。加2μl 1％二甲苯胺染料。⑤cDNA的分级分离准备好11个收集管，标记1～11，按试剂盒操作要求准备好spin-400柱子。用700μl的缓冲液洗柱子，待洗柱缓冲液流完，将上面的酶切产物约100μl平稳地加到胶层中间，直到产物全部渗到胶面下。加100μl缓冲液使染料层下降数毫米，放置好第一收集管。加600μl的缓冲液并开始收集滴出的液体，每管收集35μl。合并第2～7管，-20℃乙醇沉淀过夜。14，000 rpm离心20 min。弃上清，室温干燥10 min。加100μl去离子水溶解沉淀。4、将cDNA与pBluescriptⅡSK*载体相连10．0μl反应体系中1．0μl cDNA，1μl Vector（25 ng／ml），1μl 10X Ligation Buffer（500mMTris-HCl，100mM Mgcl2，100 mM DTT，0．5mg／ml BSA），1μl ATP（10 mM），1μl T4 DNA Ligase，5．5μl去离子水。16℃过夜。克隆载体为pBluescriptⅡSK的改造载体，具体是将EcoRⅠ和NotⅠ之间的序列改造为SfiⅠA和SfiⅠB接头序列，酶切后可定向插入cDNA片断（SfiⅠA→SfiⅠR）SfiⅠ位点在HCMV基因组中为稀有位点。5、重组质粒的转化取200μl感受态宿主菌（DH-5α）至灭菌的50ml离心管中，放置冰水浴融化。加入上述1μl连接液，轻轻混匀后置于冰上45min。42℃水浴热休克90sec，迅速放入冰上2min。加入2ml LB培养基（不含抗生素），37℃摇床，转速≤150rpm，复苏45min。3000rpm离心10 min收菌，用250μl LB重悬。取250μl菌液涂布于15cm培养皿上（Apr-IPTG／x-gal LB固体培养基），37℃过夜。6、克隆测序随机挑选26个克隆，5’端单向测序，其中部分克隆双向测序。结果一、UL141基因多态性（一）临床株UL141A核苷酸和氨基序列分析对29株低传代临床分离株和2个尿标本进行HCMV UL141全序列PCR扩增，20株分离株和1个尿标本阳性，总阳性率为67．7％。应用BioEdi软件对Toledo株及21个UL141基因核苷酸序列进行线形化比较，分析结果表明，所有低传代临床分离株和临床尿标本UL141基因在Toledo株UL141序列的核苷酸位点227均有核苷酸T的缺失（见图2a），产生两个新的ORF，分别命名为UL141A、UL141B（图2b．）。Toledo株UL141 ORF全长1278bp，所有临床分离株UL141A位于Toledo株UL141核甘酸序列第1至第316位，全长309bp或315bp，ORFb位于Toledo株UL141核甘酸序列第262至第1278位，全长1017bp。临床株UL141A核苷酸和氨基酸与Toledo株相应区域比较，同源性分别为95．9-98．7％和70．2-74．0％。10个分离株在Toledo株第78-83核苷酸位点有6个碱基的缺失，使预测编码蛋白质第26位氨基酸产生突变，由天冬氨酸突变为谷氨酸，而27、28位的甘氨酸和谷氨酸缺失。因所有临床分离株UL141A在Toledo株227核苷酸位点均缺失碱基T，造成移码突变，使预测编码蛋白质第76位以后的氨基酸产生大量变异（见图4）。（二）临床株UL141B核苷酸和氨基序列分析21个临床株和来源于Genbank的8个参考株UL141B核苷酸序列比较表明，UL141B高度保守。所有UL141B核苷酸序列同源性为96．9-100％，其中来自本研究中的21个核苷酸序列同源性为96．9-100％，来自于Genbank的8个核苷酸序列同源性为97．1-99．2％。UL141B预测编码蛋白质含有338个氨基酸，分子量为39KD。所有UL141B氨基酸序列高度保守，同源性达到97．6％-100％。（三）UL141A和UL141B进化树分析应用DNAStar软件包中的MegAlign软件进行UL141A和UL141B的进化树分析。在本研究中获得的来自不同临床表现的UL141A序列在进化树中的分布未发现明显规律（图6）。UL141B的进化树分析表明，来自Cardiff的四个参考株（6397，merlin，3157和3301）未能成为一组；未经传代的临床株和参考株84，W和3301分布在不同的分支中；来自本研究不同临床表现的分离株在进化树中的分布中亦未发现明显规律（图7）。二、UL141基因转录子结构研究（一）3’RACE和5’RACE扩增结果首先以UL141A 3’Outer Primer、UL141A 3’Inner Primer和3’RACE OuterPrimer、3’RACE Inner Primer对3个HCMV分离株进行3’RACE巢式扩增，分离株H和X扩增结果为阴性，分离株CH产生了一个DNA片段。用UL141B 3’OuterPrimer、3’RACE Outer Primer对3个HCMV分离株进行了3’RACE扩增，分离株H产生了一个1000bp左右的产物，而另外两个分离株扩增阴性。因此又使用UL141B 3’Inner Primer和3’RACE Inner Primer对3个分离株进行3’RACE巢式扩增，均产生了1个750bp左右的片段。未接种HCMV的人胚肺细胞总RNA样品做为阴性对照。3个分离株的5’RACE扩增产生了不同的扩增结果。分离株H为3个片段，分别约为500bp，200bp和100bp；分离株X为1个约500bp的片段；分离株CH为1个1000bp的片段。3个分离株的TAP（-）和M-MLV（-）的负对照扩增结果均为阴性。（二）转录子mRNA序列分析分离株H的5’RACE扩增产物与3’RACE巢式扩增产物拼接产生了分别为1154bp、954bp和852bp的转录子。三个转录子的5’端跨越了301bp，分别位于UL141B ORF 5’端上游-88nt，ORF内部132nt和213nt。3’端均位于UL141B ORF 3’端下游3-23nt处的PolyA信号处。分离株X的5’RACE扩增产物的序列与3’RACE巢式扩增产物拼接产生了一个长度为1223bp的转录子。5’端位于UL141B ORF 5’端上游-165nt，3’端位于UL141B ORF 3’端下游3-23nt处的PolyA信号处。分离株CH的5’RACE扩增产物的序列与3’RACE巢式扩增产物拼接产生了一个长度为1969bp的转录子。与分离株H相应区域的DNA序列对比，该片段5’末端位于UL140 ORF上游-29nt，3’端位于UL141B ORF 3’端下游3-23nt处的PolyA信号处，并且mRNA序列3’末端存在19个多聚腺苷酸结尾。未发现剪切和拼接。（三）转录子ORF的确定分离株H的三个转录子中确定的ORF长度分别为1017bp，894bp和708bp。最长的ORF与UL141B ORF一致。另外两个ORF与UL141B ORF的124nt至1017nt和310nt至1017nt同源。分离株X的转录子中确定的ORF长度为1017bp，与UL141B ORF一致。分离株CH的转录子中确定了两个分别与UL140基因和UL141B基因相同的ORF。（四）转录子5’非编码区的序列分析在分离株H和X中确定的所有ORF的起始密码子ATG至UL140 ORF终止子TGA之间的非编码区的DNA序列中均未发现典型的转录起始信号TATAA盒或类似的其它转录起始信号序列。三、HCMV全长cDNA文库构建（一）HCMV全长cDNA文库容量、重组律和评价1、HCMV全长cDNA文库容量1．12×106，重组率为95％。3、文库评价共随机筛选26个克隆进行5’端单向测序，去掉低质量的序列、屏蔽掉载体、去掉100bp以下的序列后还剩22条有效序列。同时对序列进行全长分析，在22条序列中有20条序列有相关同源信息，结果为其中15条全长，完整性比率为75％。（二）HCMV cDNA克隆测序经过在NCBI网站进行BLAST搜索，在22条序列中有9个序列（40．9％）在HCMV基因组中找到了同源序列。我们将以往HCMV基因转录的研究中未见报道的3条序列的克隆进行了完整测序。同源性比较发现，克隆024序列包含了HCMV Towne株中预测基因UL153的ORF（开放阅读框架）序列。与Towne株UL153 ORF克隆024序列预测的ORF 5’端比UL153 ORF向前延伸61个碱基，3’端向后延伸12个碱基。两个ORF的阅读框架没有发生移码突变。克隆021序列与HCMV AD169株中的预测基因UL87 ORF内部第1135nt至1909nt的反相互补序列同源。克隆023序列3’端的245bp的序列与HCMVAD169株中预测的UL30基因1nt至245nt同源，5’端位于预测的UL30基因上游-327nt。这两个转录子的序列与同源的DNA序列比较未发生剪切和拼接。但是，应用DNAStar软件包对这两个mRNA序列进行ORF预测，未找到可能的ORF。克隆006序列未进行完整测序。5’端的测序结果为760bp，同源分析表明它与HCMV AD169中的预测基因IRL4（TRL4）的上游的164bp序列、ORF全部序列和下游的79bp序列同源。结论1、HCMV UL141片段广泛存在于临床分离株中。2、与Cha等测序的Toledo株比较，所有临床分离株UL141基因在第227位核苷酸均缺失碱基T。预测产生两个新的ORF（UL141A，UL141B）。3、UL141A不具有转录的能力。4、UL141B ORF无论在核苷酸还是在氨基酸水平均高度保守。UL141B基因至少存在4种转录子结构。5、成功构建HCMV全长cDNA文库，获得了4个新的转录子结构，并且发现HCMV中可能存在3个的新基因。