液态基因芯片技术的建立及其在Y染色体微缺失检测中的应用

论文摘要

目的影响男性不育的因素有很多，近年来的研究表明，Y染色体上存在着精子发生调控基因即无精子症因子（azoospermia factor，AZF），其缺失引起的生精障碍是导致男性不育的重要原因，表现为原发性无精子症（azoospermia）或少精子症（oligospermial）。随着对Y染色体微缺失研究的深入和细致，需要检测的位点和基因越来越多，建立一套高效率的Y染色体微缺失多重PCR筛查系统，可以避免过多的重复实验，适应临床和科研需要。目前大多数实验室采用的多重PCR-电泳检测方法在技术上仍存在易发生实验室污染而使结果的可靠性降低的缺点；结果判断时往往发现有些条带模糊，因此易出现一些假阳性和假阴性结果。本实验室建立多重PCR—液态基因芯片技术，用于检测原发性无精症和少精症患者Y染色体AZF区域微缺失。并应用所建立的液态基因芯片方法对原发性无精症和少精症患者及正常生育男性进行Y染色体微缺失的分子检测，验证所建立的方法的可行性，确定无精症和少精症患者的缺失率，探讨Y染色体上部分生精基因的缺失与原发性无精症和少精症的关系及其分布规律。方法选取Y染色体长臂上的无精症因子AZFa（sY84）、AZFb（sY127、sY134）、AZFc（sY254、sY255）三区共5个STS位点，并以男性特有的性别决定基因（sex determining region Y，SRY）的基因序列和12号染色体上的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）的基因序列作为内对照。正常男性、女性DNA分别为阳性对照、阴性对照。利用PRIMER 5．0软件分别设计出7对引物扩增序列及检测PCR扩增产物的7条探针。建立多重PCR反应体系、杂交反应体系，对影响杂交反应的因素做了分析。并用该技术对178例无精症、134例少精症患者和40例正常男性对照进行Y染色体微缺失检测。结果1、建立sY14（SRY）、sY84、sY127、sY134、sY254、sY255、GAPDH7重PCR反应体系。2、建立七重PCR—液态基因芯片技术，并对液态基因芯片技术应用于检测Y染色体AZF区域微缺失的重复性做了研究性分析，结果显示，变异系数（CV％）范围在2.2％～7.8％之间。3、312例无精症、少精症患者中，40例有AZF区域STS位点或基因的缺失，总缺失率为12.8％。178例无精症患者中，25例出现AZF位点缺失，缺失率为14％；114例少精症和20例严重少精症患者中，分别有11例（9.6％）和4例（20％）出现AZF位点缺失。在40例缺失患者中，19例为AZFc区域缺失，13例为AZFa和4例AZFb区域缺失。另外，有4例患者同时缺失AZFb和AZFc。4、对照组中未发现缺失，经统计学处理，实验组与对照组缺失率有显著性差异（x2=5.788，P＜0.05）。结论1、运用液态基因芯片技术检测Y染色体微缺失，具有高通量、灵敏度高、特异性强、重复性好、快速简便、自动化等优点，与多重PCR相结合使对无精症和少精症的诊断更加准确、可靠。2、Y染色体微缺失与原发性无精症、少精症有关。在原发性无精症、少精症患者中Y染色体上AZF微缺失总发生率约为12.8％（40／312），其中无精症患者的发生率是14％，少精症患者的发生率是11.2％。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 液态基因芯片技术检测Y染色体AZF区域微缺失方法的建立
• 1.引言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 研究对象
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 溶液和缓冲液的配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 引物、探针的设计及合成
• 2.2.3 探针与微球的偶联
• 2.2.4 提取正常男性外周血基因组DNA
• 2.2.5 PCR反应体系的建立
• 2.2.6 杂交体系的建立
• 2.2.7 正常男性DNA标准样品的检测
• 2.2.8 杂交检测方法重复性的测定
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增结果
• 3.1.1 单重PCR扩增结果
• 3.1.2 七重PCR扩增结果
• 3.2 杂交时间的优化结果
• 3.3 正常男性DNA标准样品的检测结果
• 3.3.1 单重PCR产物的检测结果
• 3.3.2 五重PCR产物的检测结果
• 3.3.3 七重PCR产物的检测结果
• 3.4 杂交重复性的测定结果
• 3.5 结果判定
• 3.5.1 数据有效性分析:
• 3.5.2 待测样本分析
• 4 讨论
• 小结
• 第二章 液态基因芯片技术检测Y染色体AZF区域微缺失方法的临床应用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 研究对象
• 1.1.2 主要试剂和仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 提取外周血有核细胞基因组DNA
• 1.2.2 PCR扩增
• 1.2.3 杂交
• 1.2.4 用Luminex 100多功能流式点阵分析仪分析样品
• 2 结果
• 2.1 临床标本的检测结果
• 2.2 实验组与对照组缺失率的比较
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 在读硕士阶段论文情况
• 致谢