淋巴瘤血管内皮细胞异常表达Tim-3:一种新的肿瘤免疫逃避机制的探索研究

论文摘要

第一部分激光捕获显微切割结合cDNA微矩阵技术筛选淋巴瘤血管内皮细胞特异性分子【背景与目的】肿瘤的发生、发展依赖持续的血管新生,肿瘤新生血管不仅为肿瘤生长提供营养,也为肿瘤进展提供重要的播散途径。尽管靶向新生血管的肿瘤治疗策略已经取得初步成功,但对肿瘤血管内皮细胞特异的、关键的分子本质还缺乏深入认识。本研究应用cDNA微矩阵方法对淋巴瘤和反应性增生淋巴结血管内皮细胞的基因表达的差异性进行比较研究,寻找淋巴瘤血管内皮细胞的特异性分子。【方法】采用激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection,LCM）技术从淋巴瘤及反应性增生淋巴结的冰冻组织切片中捕获均一同质性的血管内皮细胞,微量抽提RNA,并经RNA体外线性扩增,并与Affymetrix GeneChip array HG U133 Plus 2.0寡核苷酸表达谱芯片进行杂交及扫描,通过计算机应用Feature Extraction软件分析和处理数据。【结果】淋巴瘤组织中血管内皮细胞与反应性增生淋巴结血管内皮细胞相比,至少有14条基因上调表达1倍以上;有13条基因下调表达1倍以上。【结论】应用cDNA微矩阵技术分析显微切割的血管内皮细胞的基因表达谱,初步筛选出了淋巴瘤相关血管内皮细胞的特异性表达分子,为研究抗淋巴瘤血管生成提供了新的分子靶点。第二部分Tim-3分子在淋巴瘤血管内皮细胞的表达研究【目的】研究Tim-3在淋巴瘤和反应性增生淋巴结血管内皮细胞的表达情况,进一步明确Tim-3为淋巴瘤血管内皮细胞的特异性分子。【方法】用原位杂交和免疫组织化学染色检测Tim-3在淋巴瘤和反应性增生淋巴结血管的表达;原代分离淋巴瘤及反应性增生淋巴结血管内皮,用免疫荧光技术观察Tim-3的表达及定位;RT-PCR技术检测10例淋巴瘤和2例反应性增生淋巴结血管内皮膜型和可溶性Tim-3的表达。【结果】用原位杂交技术在10例淋巴瘤标本中检测到8例Tim-3 mRNA,而10例反应性增生淋巴结血管只检测到2例Tim-3 mRNA; Tim-3在淋巴瘤血管内皮的表达阳性率为52.38%,而在反应性增生淋巴结的表达阳性率为10.34%;两者之间的表达差异具有显著的统计学意义（P< 0.01）; 10例原代分离的淋巴瘤血管内皮中有7例检测到Tim-3的荧光,均为内皮细胞膜表面荧光,2例反应性增生淋巴结血管均未检测到Tim-3的表达;10例淋巴瘤血管内皮检测到8例Tim-3 mRNA,均为膜型,2例反应性增生淋巴结未检测到Tim-3的表达。【结论】Tim-3异常高表达于淋巴瘤血管内皮细胞是值得深入研究的现象。第三部分Tim-3在非霍奇金淋巴瘤血管内皮细胞的表达与局部免疫状态和临床特征的相关性研究【目的】探讨Tim-3在非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin’ s lymhoma, NHL）血管内皮细胞的表达与瘤体局部免疫状态和临床特征之间的相关性。【方法】采用免疫组织化学染色法对85例NHL标本进行CD34和Tim-3染色,CD34染色用于计数微血管密度（microvessel density,MVD ）;随机选择Tim-3阳性和Tim-3阴性的弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphomas,DLBCL）标本各12例进行连续切片,分析CD4、CD8和CD1a的表达情况。【结果】应用线性回归分析发现Tim-3在NHL血管内皮细胞的表达与MVD有显著相关性（r = 0.446, P<0.001） ; Tim-3阳性和Tim-3阴性的DLBCL标本CD8和CD1a的表达差异没有统计学意义（P>0.05）, Tm-3阳性的DLBCL标本CD4细胞的百分比为4.41%±6.87%,明显低于Tim-3阴性的标本11.30%±7.51%,（P= 0.030） ; Tim-3在NHL血管内皮细胞的表达与NHL的临床分期,B类症状,国际预后指数（international prognosis index, IPI）呈显著性相关。【结论】Tim-3在NHL血管内皮细胞的表达与瘤体局部的免疫状态和临床特征密切相关,淋巴瘤血管内皮细胞特异性表达Tim-3,可能与淋巴瘤新生血管和肿瘤病灶逃避机体抗肿瘤免疫有关。第四部分研究血管内皮细胞与自体T淋巴细胞相关作用的细胞模型的建立【目的】为探讨Tim-3在血管内皮细胞表达与免疫细胞相互作用,必须建立合适的体外研究细胞模型,本研究将验证脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelialcells,UVEC）与自体淋巴细胞共刺激模型的有效性。【方法】用IFN-γ处理分离的UVEC,流式细胞仪检测UVECs表面MHC分子和共刺激分子表达情况;构建含破伤风杆菌外毒素（tetanus toxin, TT）FrC段中能强效诱导CTL的865-1120-1162-1169氨基酸序列的腺病毒ADV-TT,转染UVEC作为淋巴瘤的替代抗原,与自体脐血淋巴细胞混合培养,羧乙基锗倍半氧化物（6-carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester, CFSE）-流式细胞仪检测淋巴细胞增殖情况;检测UVEC转染ADV-TT后,UVEC的增殖和凋亡情况。【结果】UVEC组成性表达MHC-I分子和CD58共刺激分子,用IFN-γ处理后UVEC表达MHC-Ⅱ类分子,不表达CD86共刺激分子;成功构建ADV-TT作为淋巴瘤的替代抗原,能够有效刺激淋巴细胞增殖;合适感染复数的ADV-TT转染UVEC不影响内皮细胞的增殖与凋亡。【结论】UVEC与自体淋巴细胞混合培养模型能够作为合适的体外细胞模型研究淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3对抗原特异性T细胞免疫应答的效应。第五部分淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3对抗原特异性T细胞免疫应答的效应研究【目的】探讨淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3对抗原特异性T细胞免疫应答的影响,初步阐明淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3对抗肿瘤免疫的作用。【方法】CFSE-流式细胞仪检测与转染了不同病毒突变体的UVEC的自体淋巴细胞的增殖情况;Biomed-2标准化T细胞受体基因重排技术检测不同处理组T细胞克隆的变化;LDH杀伤活性检测法检测激活的T淋巴细胞对不同处理组UVEC的杀伤效应;流式细胞仪检测不同处理组自体淋巴细胞细胞亚群的比例;流式细胞微球芯片捕获技术（CBA技术）分析各处理组细胞培养上清中TH1和TH2型细胞因子的差异。【结果】与其他各组相比,ADV-Tim-3组淋巴细胞的增殖能力明显受抑（P<0.05）,淋巴细胞增殖能力随着ADV-Tim-3病毒滴度增加呈下降趋势;自体淋巴细胞与转染了ADV-TT的UVEC混合,可检测到T细胞受体γ克隆增殖,ADV-Tim-3抑制了该克隆的增殖;Tim-3具有保护UVEC使其免于淋巴细胞的杀伤作用;ADV-Tim-3显著抑制了CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群增殖（P<0.05）,CD4+/CD28high比例显著降低（P<0.05）,CD8+/CD28high和Treg群体与对照相比差异无明显统计学意义（P>0.05）, ADV-Tim-3明显抑制CD4+IFN-γ+而非CD8+IFN-γ群体;Tim-3促进TH2型细胞因子IL-10的产生,抑制TH1型细胞因子IFN-γ、TNF-a产生。【结论】淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3抑制抗原特异性CD4+T淋巴细胞的激活,起到保护性的免疫效应,这也可能是肿瘤免疫逃避的新机制。第六部分Tim-3在淋巴瘤血管内皮细胞表达促进淋巴瘤的进展【目的】体内研究淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3对淋巴瘤生长和抗淋巴瘤免疫的调节效应。【方法】建立具有人淋巴瘤临床特征的TA2小鼠淋巴瘤模型;观察各处理组模型鼠的成瘤率和瘤体体积;流式细胞仪分析各处理组外周血和脾脏CD4+及CD8+细胞比例,分析各处理组血清、脾脏和瘤体局部TH1及TH2型细胞因子的差异;免疫荧光技术检测各处理组瘤体局部CD4和CD8细胞比例。【结果】内皮细胞转染ADV-Tim-3组模型鼠肿瘤发生早,淋巴瘤体积大,外周血和脾脏CD4+细胞比例显著低于对照组（P<0.05）,血清、脾脏和瘤体局部的TH1型细胞因子明显低于对照组（P<0.05）,瘤体局部的CD4+细胞比例显著低于对照组（P<0.05）。【结论】淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3参与了对淋巴瘤的免疫逃避,促进了淋巴瘤的生长与播散。

论文目录

• 前言
• 第一部分 激光捕获显微切割结合cDNA微矩阵技术筛选淋巴瘤血管内皮细胞特异性分子
• 中文摘要
• Abstract
• 正文
• 参考文献
• 第二部分 Tim-3分子在淋巴瘤血管内皮细胞的表达研究
• 中文摘要
• Abstract
• 正文
• 参考文献
• 第三部分 Tim-3在非霍奇金淋巴瘤血管内皮细胞的表达与局部免疫状态和临床特征的相关性研究
• 中文摘要
• Abstract
• 正文
• 参考文献
• 第四部分 研究血管内皮细胞与自体T淋巴细胞相关作用的细胞模型的建立
• 中文摘要
• Abstract
• 正文
• 参考文献
• 第五部分 淋巴瘤血管内皮细胞表达Tim-3对抗原特异性T细胞免疫应答的效应研究
• 中文摘要
• Abstract
• 正文
• 参考文献
• 第六部 Tim-3在淋巴瘤血管内皮细胞表达促进淋巴瘤的进展
• 中文摘要
• Abstract
• 正文
• 参考文献
• 综述
• 附录
• 致谢