论文摘要
Stathmin是一种广泛存在于胞质中、高度保守的磷酸化蛋白,分子量19kDa,由定位在人类染色体1p36.1上STMN1基因编码产生的。由于被不同的实验室独立发现,因此又称为op18、p18、p19、metablastin、pp20等。这里用Stathmin表示蛋白,STMN1表示基因。Stathmin作为一种微管解聚蛋白,通过作用于微管蛋白,调节微管动力、纺锤体形成进而影响细胞周期,改变细胞的增殖、分化、凋亡、迁移等生物学行为。其功能紊乱会产生持续的微管组装及无法控制的细胞周期,导致肿瘤形成。研究证实Stathmin在多种人类肿瘤细胞中呈高表达,参与肿瘤发生、发展的重要信号转导分子。最近兴起的RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术,以其快速、简便、高效的抑制基因表达受到了极大的关注,是目前研究基因功能最有效的方法之一。研究表明,利用RNAi技术可同时封闭多个癌基因,对诱导肿瘤细胞凋亡抑制其增殖和远处转移具有重要的意义。本课题首先采用荧光差异显示的双向凝胶电泳（two dimensional difference in gel electrophoresis,2D-DIGE）比较敏感和耐药的K562细胞株的全蛋白质表达谱,质谱分析获得差异蛋白质的肽质量指纹图谱及生物信息学分析进行差异蛋白质鉴定,获得候选的相关蛋白,挑选其中表达上调的Stathmin,进行相关研究。应用蛋白印迹技术（Western blot）验证不同白血病细胞株（CA46、CEM、NB4、Jurkat、U937、敏感及耐药的HL-60和K562细胞）Stathmin蛋白表达,并以正常对照组和临床经MIC分型确诊的初治、缓解、复发的白血病患者为研究对象,应用蛋白印迹技术和实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescentquantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR）从蛋白质和基因水平检测分析Stathmin表达,分析其在急性白血病发生发展及微残留白血病判断中的作用。最后应用RNAi技术下调STMN1基因,研究其对K562及耐伊马替尼的K562/G01、耐阿霉素的K562/A02等白血病细胞株增殖、凋亡等生物学特性的影响及机制探讨。一、白血病K562细胞及其耐药株的差异蛋白质组分析应用蛋白质组学方法比较白血病细胞株K562细胞及其耐阿霉素K562/A02细胞蛋白质表达谱的差异,筛选新的耐药相关蛋白。方法：1.利用荧光差异双向电泳（DIGE）技术分离K562及K562/A02细胞的总蛋白,用MALDI串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）对差异表达的蛋白质点进行鉴定,搜索蛋白质数据库,获得差异蛋白质的信息。2.用蛋白印迹技术和实时荧光定量PCR技术从蛋白质水平和mRNA水平对差异蛋白质进行验证。结果：1.经过初步筛选和质谱分析,鉴定出8个表达差异的蛋白质,其中2个表达下调,6个表达上调,分别参与细胞能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡细胞信号转导和基因转录等。2.挑选其中表达上调的蛋白Stathmin和CrkL,其蛋白印迹实验结果与双向电泳结果一致,但实时荧光定量PCR显示Stathmin的mRNA水平变化与蛋白质水平变化无一致性。二、Stathmin在急性白血病中表达的研究应用蛋白印迹技术和实时荧光定量PCR技术检测Stathmin在急性白血病中表达的情况,希望为急性白血病诊断和微残留白血病的判断提供新的生物学指标。方法：1.收集正常人（25例）及临床经MIC分型确诊的急性白血病初治、缓解和复发患者外周血或骨髓标本（76例）,分离单个核细胞后,分别提取总RNA和总蛋白。2.应用蛋白印迹技术和实时荧光定量PCR技术检测分析其在正常人、急性白血病初治、缓解和复发患者中表达的差别。结果：1.Stathmin蛋白在正常人中不表达,其mRNA在正常人中低水平表达。2.Stathmin蛋白和mRNA在急性白血病初治患者中高水平表达,与正常人相比具有统计学意义（P<0.05）,治疗缓解的患者Stathmin蛋白表达明显减弱或不表达,复发患者该蛋白和mRNA又恢复高表达,且mRNA表达水平高于初治者（P<0.05）。三、慢病毒介导的白血病K562细胞及其耐药株SRMN1基因沉默和鉴定应用RNAi技术沉默白血病K562细胞及其耐药株STMN1基因,并检测其对目的细胞STMN1基因的干扰效率。方法：1.构建针对STMN1基因的shRNA表达载体,通过与STMN1基因真核表达载体共转染293T细胞后,应用蛋白印迹技术检测Stathmin蛋白表达来筛选具有干扰效果的shRNA。2.将具有干扰效果的RNAi病毒载体质粒,经过慢病毒包装,转染目的细胞K562、耐伊马替尼的K562/G01和耐阿霉素的K562/A02细胞。3.应用蛋白印迹技术和实时荧光定量PCR技术检测RNAi对K562及其耐药株STMN1基因的干扰效率。结果：1.成功构建针对STMN1基因的shRNA表达载体,并筛选出具有干扰效果的shRNA。2.将慢病毒介导的shRNA转染目的细胞后,不同细胞中的Stathmin蛋白表达明显减弱或不表达,对STMN1基因的抑制率达80%以上。四、抑制Stathmin表达对白血病K562细胞及其耐药株生物学特性的影响及机制研究研究抑制Stathmin对K562及其耐药株的增殖、凋亡、耐药性改变等生物学作用及相关机制探讨。方法：1.MTT法、集落形成法检测细胞增殖。2.流式细胞术检测细胞周期。3.Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。4.Western blot检测凋亡相关蛋白p53、caspase-9、PARP、bax和耐药相关蛋白P-gp和GSTл。5.实时荧光定量PCR检测多药耐药基因mdr-1 mRNA表达。6.MTT法检测抑制Stathmin后对K562及其耐药株耐药性的影响。结果：1.抑制Stathmin能够导致白血病K562细胞及其耐药细胞增殖减慢,克隆形成能力明显下降。2.抑制Stathmin能够导致白血病K562细胞及其耐药细胞发生明显的G2/M期阻滞。3.抑制Stathmin能够诱导白血病K562细胞及其耐药株凋亡增加。Annexin V-FITC/PI法证实抑制Stathmin可以引起早期细胞凋亡,可能是通过激活caspase-9而启动凋亡。4.抑制Stathmin能够下调耐药细胞株K562/G01和K562/A02细胞中mdr-1 mRNA和P-gp蛋白表达,但对敏感株K562细胞中mdr-1 mRNA和P-gp蛋白表达无影响。5.抑制Stathmin可部分逆转耐药细胞株K562/G01和K562/A02细胞对伊马替尼和阿霉素的耐药性。结论：1.比较白血病K562细胞及其耐阿霉素K562/A02细胞的差异蛋白质表达谱,筛选出耐药相关蛋白Stathmin。2. Stathmin在急性白血病中高表达,可能成为急性白血病诊断和微残留白血病判断的一个新的生物学指标。3.应用RNAi技术成功下调STMN1基因,并证实抑制Stathmin表达可导致敏感和耐药的K562细胞增殖减慢、G2/M期阻滞和凋亡增加等生物学特性,并可部分逆转K562耐药细胞株的耐药性。