DNA甲基化和去甲基化细胞模型的建立及应用

论文摘要

表观遗传学是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变,其中DNA甲基化是调控表观遗传学变化的重要机制之一。DNA甲基化是指基因组DNA 5-胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine,5-mC）,它是一种在哺乳动物中稳定而且广泛存在的表观遗传修饰方式,通常位于基因的5’端,特别是启动子区或基因的第一个外显子区。DNA甲基化调控着重要的生物学现象,比如X染色体的失活、遗传印记、染色质结构以及基因表达,并且在细胞分化和胚胎发育过程中也起着极其重要的作用。异常的DNA甲基化在包括癌症的多种疾病中都扮演着重要的角色。肿瘤细胞表现出基因组DNA整体低甲基化和CpG岛局部高甲基化,从而导致基因组的不稳定（如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达）和抑癌基因的不表达。基于DNA甲基化对于疾病的重要意义,研究DNA去甲基化的机制则十分重要。目前已有的研究主要从两方面着手：（1）被动去除DNA甲基化,比如利用5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-dc）, HDAC（histone deacetylase）抑制剂TSA（Trichostatin A）, RNA干扰（RNA interference, RNAi）,甚至利用微小RNA（microRNA, miRNA）下调DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1, DNMT1）。但是这些方法有其弊端,首先它们做不到位点特异,很难有针对的去除DNA甲基化；其次,甲基转移酶抑制剂对细胞有毒性,会引起广泛的细胞生物学效应,导致细胞整体的甲基化丢失,难以做到长时间观察和研究；最后,甲基化的检测也较麻烦,不易高通量检测去甲基化的因素,这也间接提高了最终的检测成本。因此,也就为研究DNA去甲基化以及DNA甲基化与组蛋白修饰之间的关系造成了麻烦。（2）实现DNA主动去甲基化。有文献报道通过嵌合DNA甲基化转移酶到Gal4 DNA结合结构域（DBD）上,可以定点甲基化特异的DNA序列,并且抑制靶基因的表达,然而他们利用瞬时转染的质粒DNA无法真实再现染色体DNA的状态。目的：（1）目前还没有一种通用的实验方法,可以有目的的位点特异性除去甲基化,因此我们希望建立一种通用的细胞模型,能够在体外研究染色体DNA特定位点去甲基化以及甲基化,并能做到长期稳定的观察。（2）VP16是一种单纯疱疹病毒蛋白,是含有酸性激活区域的一种转录激活蛋白。在本论文中我们利用VP16作为强激活结构域来激活报告基因从而筛选单克隆细胞。另外,有文献报道,VP16通过与抓蟾卵中宿主DNA结合结构域的作用在启动子区表现有增强去甲基化的作用。而根据我们的实验结果发现VP16的转录激活与细胞的甲基化程度成负相关,因此我们检测是否VP16在哺乳细胞中也有同样的DNA去甲基化的作用。（3）为了更进一步的验证细胞株的功能,我们还选取了一种羟甲基化酶TET1和一种化学物质茶多酚作为研究对象,利用筛选出的细胞作为模型研究它们是否对DNA甲基化有影响。方法：（1）构建人工CpG岛报告基因载体,PCBS-luc。以PCDNA3.1作为骨架,依次插入了luciferase报告基因, SV40启动子, BD结构域结合位点和一段高CpG片段。将PCBS-luc用限制性内切酶PstI线性化并用CpG甲基转移酶M.SssI进行人工甲基化处理,甲基化质粒PCBS-luc（或非甲基化质粒PCBS-luc）与anti-hygromycin基因表达载体共转HEK293细胞,使用潮酶素B（hygromycin B）筛选出单克隆稳转细胞株。利用报告基因活性检测对各细胞克隆进行第一批筛选,选取活性较高和较低的细胞株进行后续检测,用PCR鉴定细胞株是否稳定整合PCBS-luc并进一步用BSP方法确认各细胞株中PCBS-luc启动子区的甲基化状态。（2）转染PMIPVP16到甲基化细胞株7#,使用嘌呤霉素（puromycine）加压筛选稳定表达细胞,分析启动子区甲基化程度的改变。（3）转染PMIPTET1CD质粒到甲基化细胞株7#,在细胞内表达BD-TET1CD融合蛋白,通过BD结构域与细胞基因组中稳定整合的Binding sites结合,在已备甲基化的人工CpG岛附近引入TET1的羟基化催化结构域（CD）, TET1CD,使得人工CpG岛附近的甲基化转换为羟甲基化。使用puromycine加压富集阳性转染细胞,测定Luciferase检测基因表达活性的改变并用BSP分析人工启动子区CpG岛甲基化状态。（4）用20 ug/ml和100 ug/ml的茶多酚分别处理完全甲基化细胞9#和完全非甲基化细胞8#,BSP分析人工启动子区CpG岛甲基化状态。结果：（1）筛选出13株甲基化细胞和8株非甲基化细胞,确认了3株不同甲基化程度的细胞,完全甲基化细胞株9#、部分甲基化细胞株7#和完全非甲基化细胞株8#。（2）利用同样的PCR及BSP的方法对传至第15代的细胞株进行了整合性及甲基化状态的鉴定,确认部分甲基化细胞株7#和完全非甲基化细胞株8#的甲基化及非甲基化状态不会随细胞传代而丢失。（3）利用细胞模型首次发现VP16在哺乳细胞中有诱导DNA去甲基化的作用。（4）确认羟甲基化具有一定的转录激活的活性,并探索了5-羟甲基胞嘧啶修饰对基因启动子区DNA甲基化的影响,初步发现在某些特异的位点上TET1的羟基化催化结构域具有DNA去甲基化的作用,但启动子区整体甲基化水平并未发现明显改变。（5）在我们的实验条件下,发现20ug/ml的茶多酚对非甲基化细胞8#中的个别位点具有DNA甲基化的作用,而100ug/ml的茶多酚对非甲基化细胞则并无影响。20 ug/ml和100 ug/ml的茶多酚对甲基化细胞9#没有影响。结论：我们成功建立了可用于研究DNA甲基化及DNA去甲基化的细胞模型,并利用该模型首次发现了VP16蛋白在哺乳细胞中具有诱导DNA去甲基化的作用。此外,还利用细胞模型确认了TET1CD及20 ug/ml茶多酚对与细胞DNA甲基化的影响,这些初步的实验结果有望为后续进一步实验研究提供依据和思路。

论文目录

• 英文缩略语注释
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 DNA甲基化和去甲基化细胞模型的建立
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 DNA甲基化和去甲基化细胞模型的应用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 总结与展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 研究生期间论文发表及奖励
• 致谢