论文摘要
癌症是威胁人类健康的最大疾病,寻找高效、特异性杀伤恶性肿瘤细胞的新抗癌资源成为癌症治疗的主要研究方向。抗菌肽是一类广泛存在于生物界的抵抗病源微生物入侵的重要防御分子,具有抗细菌、真菌以及抗癌等多种生物学功能,成为一类重要的抗菌抗癌资源。抗菌肽ABP-CM4是由36个氨基酸组成的阳离子抗菌肽,具有一定的抗癌活性,但是抗癌活性并不高,并且对多数恶性肿瘤细胞不敏感。然而,ABP-CM4高度选择性杀伤恶性肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的特征使其成为一种非常有抗癌潜力的抗菌肽,如何提高ABP-CM4的抗癌活性而不影响其选择性成为迫切需要研究的课题。豆蔻酰化修饰是蛋白质翻译后的重要修饰类型,在介导蛋白质-蛋白质,蛋白质-生物膜相互作用中发挥着重要的作用。本研究尝试对ABP-CM4进行了豆蔻酰化修饰,分析抗癌活性,探讨抗癌机理,获得如下结果：1.通过增殖抑制实验（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐MTT）检测了豆蔻酰化CM4对乳腺癌细胞MDA-MB-231, MX-1,肝癌细胞HepG 2,前列腺癌细胞DU145和PC-3,神经胶质母细胞瘤U251 MG等6种肿瘤细胞和HEK293、L022细胞2种正常细胞的细胞毒性,结果表明,豆蔻酰化的CM4对于六种细胞的半数致死浓度（IC50）降低了30倍左右。而对正常细胞的毒性远远小于对于癌细胞的毒性。溶血性实验结果表明豆蔻酰化CM4在实验使用浓度范围内,不表现出溶血性。以上结果表明豆蔻酰化显著的增强了抗菌肽CM4的抗肿瘤活性,扩大了抗肿瘤范围,而且豆蔻酰化CM4仍然具有良好的选择性。2.通过CD光谱实验检测豆蔻酰化CM4二级结构变化,CD光谱显示,修饰之后的抗菌肽有着更高的α螺旋含量。通过激光焦显微镜和流式细胞仪,检测了豆蔻酰化CM4与细胞膜的结合能力的变化,结果显示,豆蔻酰化不仅增强了抗菌肽和肿瘤细胞膜的结合能力,还介导了ABP-CM4的跨膜转运。通过激光共聚焦检测豆蔻酰化CM4的亚细胞定位情况,结果显示,豆蔻酰化CM4进入细胞之后,定位到线粒体,并且能够引起ROS的产生增加和线粒体电动势的降低。通过流式细胞仪检测Annexin-V/PI染色检测细胞凋亡,结果表明,豆蔻酰化CM4能诱导乳腺癌细胞的的凋亡。通过western blot检测凋亡相关蛋白,结果显示,豆蔻酰化CM4通过线粒体凋亡通路诱导肿瘤细胞凋亡。3.实验中,建立了乳腺癌小鼠模型,采用了顺铂作为阳性药物,以及2.5mg/kg,, 5mg/kg豆蔻酰化CM4进行治疗。肿瘤体积和重量检测结果显示,豆蔻酰化CM4能够显著的抑制肿瘤的生长。肿瘤切片的组织化学染色结果显示豆蔻酰化CM4能够抑制肿瘤细胞的增殖,能够通过介导细胞凋亡和抑制血管生成来抑制肿瘤生长。综上所述,实验中,首次使用了豆蔻酸对CM4进行了修饰,并且检测了豆蔻酰化CM4对于肿瘤细胞的毒性作用以及初步探究了细胞毒性机理的研究。实验结果证明,豆蔻酰化能够显著的增强抗菌肽CM4的抗肿瘤活性,扩大了抗肿瘤谱。在体内外豆蔻酰化的CM4能够通过有效地,选择性的诱导肿瘤细胞凋亡,抑制血管生成从而抑制肿瘤的生长。因此,豆蔻酰化CM4成为抗癌药物提供了一种资源,抗菌肽应用于临床提供了理论依据,同时提高抗菌肽抗肿瘤活性提供了一种新的方法。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导受体（TRAIL）是一种具有选择性的抗肿瘤蛋白,现在也进入临床试验阶段。蜂毒肽是从蜜蜂体内分离出来的一种对于中瘤细胞和正常细胞都有强烈的杀伤作用的抗菌肽。因此,为了能够降低蜂毒肽的毒性,并且增强TRAIL对于肿瘤细胞的毒性,构建了一种新的融合蛋白sTRAIL-melittin。实验中,利用SUMO载体,构建了sTRAIL-融合蛋白表达载体。使用Ni柱进行纯化,特异性的SUMO酶切割之后,得到sTRAIL-蛋白。通过增殖抑制实验（MTT）检测了融合蛋白对于K562白血病细胞,HepG 2肝癌细胞,人胚肾细胞HEK293的细胞毒性以及溶血性实验,实验结果表明,融合蛋白可以通过凋亡作用引起K562白血病细胞和HepG2肝癌细胞的死亡,但是对于红细胞和正常的HEK239细胞则仅仅具有很小的作用,对于肿瘤细胞的作用相对于TRAIL有明显的提高（P<0.01）。通过AnnexinV/PI双染,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,实验结果显示,融合蛋白可以引起K562细胞和HepG 2细胞的凋亡。同时发现,sTRAIL-melittin表现出对于金黄色葡萄球菌的杀伤作用。综上所述,实验得到了一种抗肿瘤、抗细菌的融合蛋白,TRAIL与一种抗菌肽融合可以作为一种新的,以TRAIL为基础的抗癌治疗的新选择。