荒漠藻胞外聚合物抗肿瘤活性及其机理研究

论文摘要

目的:荒漠藻在自身的正常代谢过程中,不断地向周围环境中分泌以多糖、蛋白糖为主的胞外聚合物。这些胞外聚合物是它们适应荒漠环境的生命支持系统,具有抗干旱、抗氧化、抗辐射、抗盐碱,及粘结沙粒等生态学功能。本文以皮肤癌细胞A431为供试细胞,研究了M. vaginatus, P. tenue, S. javanicum、Desmoloccus olvaceus和Nostoc sp.五种荒漠藻胞外聚合物对其细胞凋亡过程的影响,目的在于发现这些聚合物的抗肿瘤活性及其发挥作用的机理。方法:使用MTT法检测聚合物对A431细胞存活率的作用,用倒置显微镜直接观察A431细胞形态方面的变化,透射电镜再次揭示了细胞超微结构的改变;利用流式细胞仪分析了对A431细胞的存活率和细胞线粒体膜电位的变化,采用免疫组化法观察了caspase-3、bcl-2和bax蛋白的表达情况,利用琼脂糖凝胶电泳检测了细胞DNA的降解,并测定了A431细胞内超氧阴离子自由基（O2-）、SOD、CAT和POD酶活性的变化。结果:EPSs在体外能够杀死A431细胞,并且有剂量-时间-效应依赖关系,凋亡率随时间延长增加;EPSs会造成A431细胞在G2/M期的停滞。线粒体膜电位的变化为:在作用24小时后,开始降低,到72小时彻底崩溃,96小时线粒体破裂。免疫组化结果显示EPSs能促进caspase-3和bax蛋白的表达,而抑制bcl-2蛋白的表达。96小时后,DNA开始降解成小片段。形态结构的变化如下:A431细胞经EPSs处理后,首先细胞变小成圆形或月牙形,胞间连接消失;超微结构显示细胞表面微绒毛消失,有“胞浆出芽现象”。细胞核凝集,染色质固缩、边缘化,形成不同形状和大小的块状;最后核膜破裂,凝聚的染色质散布到细胞浆中,没有发现凋亡小体的形成。在凋亡过程中,细胞自由基含量升高,抗氧化酶也随着发生了变化。推论:荒漠藻胞外聚合物具有明显的抗肿瘤活性。在A431细胞的凋亡过程中,胞外聚合物引起的细胞周期阻滞和线粒体膜电位降低可能是细胞凋亡的主要原因,其诱发因素很可能是自由基参与活化的caspase-3和bax下调了bcl-2的表达,使得细胞内抗氧化系统失去平衡,最后导致了细胞凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 第一节 文献综述
• 1.1 荒漠藻胞外聚合物的生态学功能
• 1.2 多糖的研究进展
• 1.2.1 多糖的结构层次
• 1.2.2 多糖的结构分析
• 1.2.3 多糖的生物活性
• 1.2.4 活性多糖的构效关系
• 1.3 细胞凋亡研究进展
• 1.3.1 凋亡细胞的生物学特征
• 1.3.2 细胞凋亡的基本机制
• 1.3.3 细胞凋亡的信号转导途径
• 1.3.4 重要的凋亡调控基因
• 1.3.5 线粒体与细胞调亡
• 1.3.6 氧自由基与细胞凋亡
• 1.3.7 细胞凋亡的研究方法
• 第二节 荒漠藻胞外聚合物的制备
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 试剂、材料和仪器
• 2.2.2 藻类培养
• 2.2.3 胞外聚合物的制备
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三节 胞外聚合物对皮肤癌细胞凋亡的诱导
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 一般溶液的配置
• 3.2.4 仪器
• 3.3 细胞的培养
• 3.3.1 常规培养方法
• 3.3.2 常规观察
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 对细胞形态的影响
• 3.4.2 对细胞的增殖的作用
• 3.4.3 对细胞周期的影响
• 3.4.4 对细胞线粒体膜电位的影响
• 3.4.5 对细胞caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响
• 3.4.6 细胞凋亡过程
• 3.4.7 对细胞超微结构的影响
• 3.4.8 对细胞抗氧化系统的影响
• 3.4.8.1 酶液的提取
• 2^-）含量的测定'>3.4.8.2 细胞内超氧阴离子自由基（O₂^-）含量的测定
• 3.4.8.3 细胞内SOD活性的测定
• 3.4.8.4 细胞内CAT活性的测定
• 3.4.8.5 细胞内POD活性的测定
• 3.4.8.6 细胞内总蛋白质含量的测定
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 对细胞形态的影响
• 3.5.2 对细胞增殖的作用
• 3.5.3 对细胞周期的影响
• 3.5.4 对细胞线粒体膜电位的影响
• 3.5.5 对细胞caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响
• 3.5.6 细胞凋亡过程
• 3.5.7 对细胞超微结构的影响
• 3.5.8 对细胞抗氧化系统的影响
• 3.6 讨论
• 3.7 小结
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间论文发表及获奖情况