刺参（Stichopus japonicus）烂皮病病灶组织显微观察及病原的初步研究

论文摘要

刺参（Stichopus japonicus）属于棘皮动物门海参纲（Holothuroidea）楯手目（Aspidochirota）刺参科（Stichopodidae）仿刺参属（Apostichopus）。刺参为温带种,在我国的分布主要在辽宁,河北,山东和江苏等沿海省。刺参营养丰富,体壁含有丰富的胶原成分和蛋白聚糖,还含有大量的黏蛋白及多种氨基酸。刺参的酸性黏多糖（硫酸软骨素）,具有抗衰老的作用,还具有较广的抗肿瘤、抗凝血以及增强机体免疫功能的作用。我国从20世纪80年代开始进行刺参养殖,目前国内刺参养殖规模不断扩大。山东、辽宁两省是我国的刺参养殖的最主要的养殖区域,青岛、威海、蓬莱等沿海城市都有大规模的刺参养殖场。随着国内刺参养殖业的迅速发展,养殖面积的迅速扩张以及集约化养殖方式下的不规范操作,养殖过程中相继出现一系列病害问题,给刺参养殖业带来了巨大的损失。“烂皮病”因其高传染性,死亡率高而成为刺参养殖病害研究的重点。该病发病特征:染病初期的海参一般先从口部出现感染,表现为围口膜松弛,触手对外界刺激反应迟钝,继而大部分海参会出现排脏现象。中期感染的刺参身体收缩,僵直,一般口腹部出现小面积溃疡,形成蓝白色小斑点,渐渐丧失摄食能力,感染末期刺参的病灶变大,溃疡处增多,表皮腐烂面积变大,最后导致刺参死亡,溶化成鼻涕状胶体。本文通过显微观察技术（H.E.染色切片观察、电子投射电镜和扫描电镜）对青岛某养殖场患病刺参和健康刺参个体进行比较。并对患病个体病灶处的优势菌群进行分离、纯化和人工回接感染实验,依据柯赫氏法则确定病原菌。并通过革兰氏染色、细菌负染形态观察、抗生素敏感实验、生化指标测定以及16S rRNA基因进化分析对病原菌进行初步鉴定和研究。并研究了病灶处优势菌群16S rRNA基因的系统发生关系。病灶处显微观察结果:患病个体表皮严重的破损,结缔组织胶原层结构不再紧实有序,变薄且成絮状,出现大量空洞。肌肉层肌腱依然可见纤维束状结构,肌肉纤维束排列紧密,但没有成规律的麦穗状排列。病灶处各组织未发现在健康个体中存在的一种泡状细泡。电子透射电镜观察结果显示患病个体结缔组织中的细胞分散,细胞间质稀疏,细胞间隙较大,胞质内结构单一。细胞核核膜结构丧失,染色质结构散乱;细胞膜结构不完整。电子扫描电镜显微观察结果显示病灶处存在大量球状细菌,多附着于骨片和胶原纤维之间。病原研究结果:共有9株优势菌株从病灶处分离纯化。编号依次为:C6、TB、4、BP1～BP6。仅菌株C6可以重复自然状态的发病状态,投放初浓度为108 CFU/mL,致死率为59%以上,确定为养殖刺参烂皮病的病原,培养菌落颜色为玉米黄色,可反射蓝色金属光泽。菌株C6为革兰氏阴性长杆菌,可弯曲,两端不生鞭毛;大小约为2μm×0.3μm,对氯霉素、林可霉素等抗生素表现为敏感;测试的16项生化指标仅氧化酶、鸟氨酸脱羧酶结果为阳性。结合表型,生化指标结果和16S rRNA基因进化分析,初步推测菌株C6为Tenacibaculum属细菌。16S rRNA基因的系统发生关系显示病灶处其他优势菌群和CFB群以及γ-变形菌门的交替单胞菌纲和弧菌纲细菌同源性最高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 养殖刺参病害问题
• 1.1 刺参简介
• 1.1.1 刺参的分类地位
• 1.1.2 形态特征
• 1.1.3 刺身分布
• 1.1.4 生活习性
• 1.1.5 生活史
• 1.1.6 营养价值
• 1.2 刺参养殖业的发展
• 1.3 刺参养殖业对生态环境的影响
• 1.4 刺参养殖病害问题
• 1.4.1 研究现状
• 1.4.2 病害类型
• 1.4.3 防治要点
• 2 海水养殖病原的主要种类
• 2.1 海水养殖鱼类病原
• 2.1.1 弧菌
• 2.1.2 海洋屈挠杆菌
• 2.1.3 假单胞菌
• 2.1.4 海水养殖鱼类其他重要病原菌
• 2.2 海水养殖甲壳类及软体动物的病原
• 2.3 国外棘皮动物门病原的研究情况
• 3 16S rDNA 与细菌的分类鉴定
• 3.1 关于16S rDNA
• 3.2 16S rDNA 在细菌分类上的应用
• 3.3 16S rDNA 序列分析的基本原理核技术步骤
• 3.3.1 基因组DNA 的获得
• 3.3.2 16S rRNA 基因片段的获得
• 3.3.3 通过16S rRNA 基因片段分析对微生物进行分类鉴定
• 3.4 16S rDNA 的数据库棘分析软件
• 3.4.1 数据库
• 3.4.2 分析软件
• 第二章 患病刺参幼参病灶处显微观察
• 1 实验用品
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验药品
• 1.4 几种常用溶液配方
• 2 实验方法
• 2.1 光镜样品制备
• 2.2 透射电镜样品制备
• 2.3 扫描电镜样品制备
• 3 实验结果
• 3.1 H.E.染色结果
• 3.2 透射电镜结果
• 3.3 扫描电镜结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三章 病原的研究
• 1 实验器材和药品
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验药品
• 2 实验方法及主要试剂配方
• 2.1 致病菌的分离纯化及人工回接感染实验
• 2.1.1 培养基的常用试剂配方
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 病原菌的生理生化指标测定
• 2.2.1 革兰氏染色
• 2.2.2 致病菌负染观察
• 2.2.3 药敏试验
• 2.2.4 生化指标
• 2.3 致病菌及病灶处优势菌群16S rRNA 基因进化树的建立
• 2.3.1 培养基基主要试剂配方
• 2.3.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 病原的分离纯化及确定
• 3.1.1 分离纯化结果
• 3.1.2 人工感染实验结果
• 3.2 菌株C6 的生理生化实验结果
• 3.2.1 药敏实验结果
• 3.2.2 负染结果
• 3.2.3 革兰氏染色及生化指标结果
• 3.3 致病菌及病灶处优势菌群165 rRNA 基因进化树的建立
• 3.3.1 PCR 结果
• 3.3.2 测序结果
• 3.3.3 Blast 结果
• 3.3.4 聚类分析
• 4 讨论
• 4.1 养殖刺参烂皮病病原及病灶处优势菌群
• 4.2 养殖刺参病害可行的解决方法
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表学术论文