鸡包涵体肝炎病毒DNA探针的制备及其流行病学调查

论文摘要

鸡包涵体肝炎（chicken inclusion body hepatitis,IBH）是由禽腺病毒引起的一种急性传染病,主要表现为病鸡死亡突然增多,严重贫血、黄疸、肝脏肿大出血和坏死灶,可见到肝细胞核内有包涵体,该病又称贫血综合征。有12种血清型的禽腺病毒与本病有关,这12个血清型中,至少有10个血清型与自然爆发的包涵体肝炎有关。引起鸡IBH的血清型主要是2型、3型、4型、5型、6型、7型和8型。我国于1976年首先在台湾省发现该病,此后在辽宁省、湖南省、江苏省、吉林省、河南省和内蒙古都相继发生,呈日益蔓延趋势,因此引起越来越大的重视,而斑点杂交技术简单的操作和较低的成本成为了检测此病的理想选择。鸡胚是鸡腺病毒的最佳分离培养物。经由卵黄囊接种,胚胎可于2-7d内死亡,常可见肝细胞嗜碱性核内包涵体,含有包涵体的胞核较正常大,可较正常大2-3倍。通过鸡胚卵黄囊接种对各血清型标准毒株进行增殖培养,根据NCBI GenBank数据库中禽腺病毒血清型1、2、4、8、12六邻体蛋白基因的标准序列,找出保守性序列和血清型之间的低同源性序列,以此来设计5对引物,分别对增殖的病毒进行DNA提取与PCR扩增,切胶回收定量后,用地高辛标记成包涵体肝炎病毒核酸探针,探针进行灵敏度检测后,表明探针的最小检出量均达到1pg,特异性检测表明各血清型探针之间无交叉反应。通过斑点杂交的检测方法,检测山东、河南、江苏部分地区采集的病料,各地均检出阳性病鸡。处理病毒各血清型的核酸探针检测到的疑似病料,经卵黄囊接种于7日龄SPF鸡胚（0.2ml/只）,取接种48小时以后死胚的肝组织,经处理后,在鸡胚继续传2代纯化病毒。回收尿囊液中病毒DNA,并用标记的5种血清型探针分别进行斑点杂交检测,同时取鸡胚肝脏用10%福尔马林固定制片,进行病理组织学检查。以尿囊液中提取的DNA为模板,对六邻体蛋白（Hexon）片段进行PCR扩增并进行测序分析。通过实验,表明了鸡包涵体肝炎病的普遍流行,其中以血清2、4、8型流行较为普遍。通过斑点杂交诊断方法检测出的阳性病料接种鸡胚后,病理组织学检查均可见核内包涵体。将Hexon序列的测序结果与血清1、2、4、8、12型的标准序列分别进行比对,同源性均在百分之九十六以上,最高达百分之九十八点八。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 文献综述
• 1 包涵体肝炎概述
• 1.1 病毒形态、理化特性及感染机理
• 1.2 流行情况
• 1.3 临床症状
• 1.4 病理变化
• 1.5 防治
• 2 核酸探针概述
• 2.1 核酸探针的概念
• 2.2 核酸探针的种类
• 2.3 核酸探针的制备
• 2.4 核酸分子杂交
• 3 禽腺病毒病的诊断方法及研究进展
• 论文研究一 禽腺病毒血清型1、2、4、8、12标准毒株的增殖与目的片段的扩增
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 论文研究二 鸡包涵体肝炎病毒DNA探针的制备及流行病学调查
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 特异性试验
• 2.2 敏感性试验
• 2.3 标记探针对临床病例病变组织的检测
• 3 讨论
• 论文研究三 病料病毒的鸡胚传代与分离检测
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 培养基及常用试剂的配制
• 2 结果
• 2.1 病料接种SPF鸡胚后肝脏的病理变化
• 2.2 石蜡切片包涵体形态的观察
• 2.3 病毒斑点杂交检测
• 2.4 PCR扩增
• 2.5 序列比较分析
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢