转录组学、蛋白质组学研究海州香薷Cu吸收与耐性分子机理及其cDNA文库的构建

论文摘要

海州香薷（Elsholtzia splendens）为唇形科香薷属一年生草本植物,对铜有较高的耐性和累积能力,被鉴定为铜耐性/富集植物。近年来,利用海州香薷进行Cu污染土壤的修复研究及海州香薷对铜吸收累积与耐性解毒的分子机理研究受到广大生物和环境科学学者的关注。本论文以海州香薷为材料,采用水培试验,运用cDNA-AFLP、实时荧光定量PCR、SDS-PAGE、2D-PAGE、MALDI-TOF MS和LTQ-ESI-MS/MS等技术,研究高铜和缺铜胁迫对海州香薷转录组和蛋白质组的影响,首次从转录组学和蛋白质组学的水平阐释了海州香薷对铜吸收累积与耐性解毒的分子机理。此外,还应用SMART技术构建了海州香薷高铜和缺铜胁迫的全长cDNA文库,为开展海州香薷功能基因组学研究提供了宝贵资源。主要研究结果如下:1、海州香薷高Cu、缺Cu胁迫的转录组学研究在转录组学研究中,采用cDNA-AFLP技术筛选海州香薷根尖（约3～5cm）基因在缺铜（0μmol/L CuSO4）和高铜（100βmol/L CuSO4）处理期间,四个时间点（0h、3h、6h和24h）基因的差异表达,获得了66个差异表达的TDF片断,Blast分析发现62个单基因,其中有43编码已知功能蛋白,6个编码未知功能蛋白,其余13个TDFs未能找到显著同源的序列信息。随机选择5个TDFs进行实时荧光定量PCR检测,结果与cDNA-AFLP表达谱带所示表达趋势一致。在62个单基因中,12个基因受高Cu胁迫的特异诱导,1个基因受缺Cu胁迫的特异诱导,其余的49个基因的表达在缺Cu和高Cu处理时都受到影响。在43个已知基因中,2个参与胞内氧化还原调控,6个与细胞内的信号转导有关,2个转录因子,1个翻译起始因子,9个核糖体基因,3个蛋白代谢相关基因,1个能量代谢相关,9个逆境胁迫防御基因,3个金属耐性与解毒相关基因,4个细胞壁代谢相关基因,2个次生代谢相关基因,以及1个叶主要表达蛋白基因。对这些基因在海州香薷铜吸收与耐受过程中的机制作了探讨。2、海州香薷蛋白质组学技术研究本研究对TCA/丙酮法、匀浆法和酚提取法三种蛋白提取方法进行比较发现酚提取法提取的海州香薷根、叶蛋白适于双向电泳研究。不同pH范围胶条的2-DE图谱比较研究表明胶条pH值范围为5-8时,海州香薷根、叶蛋白的2-DE分离效果最好。3、海州香薷高Cu胁迫的蛋白质组学研究本研究发现100μM Cu胁迫处理6天,海州香薷根系Cu含量增加了92倍,达5170.5mg/kg·干重,而叶部Cu含量仅增加了3倍。对海州香薷香薷根、叶蛋白的SDS-PAGE分析发现,Cu处理后,海州香薷根系蛋白谱带发生变化,而叶部蛋白的谱带变化不大。进一步对根叶的蛋白质组研究发现,Cu胁迫处理后,根系有45个蛋白点的表达发生变化,其中16个上调,29个下调;而叶部仅有6个蛋白点的表达发生变化,上调3个下调3个。对根系蛋白进行GO分析表明,这些蛋白具有多种分子功能,参与多个生物学过程,说明海州香薷的Cu耐性与解毒过程具有复杂的分子机制。海州香薷根系蛋白可以分为8类:氧化还原动态平衡相关蛋白、与转录翻译调控相关蛋白、信号转导和调控相关蛋白、与能量代谢相关的蛋白、细胞壁结构相关蛋白、细胞骨架相关蛋白、转运相关蛋白和胁迫相关蛋白。根据这些差异表达的蛋白我们阐释了海州香薷Cu耐性与解毒机制分子机理。4、海州香薷缺Cu胁迫的蛋白质组学研究本研究发现,缺Cu胁迫处理6天,海州香薷根系Cu含量下降了15.55%,而叶部Cu含量下降了25.98%。SDS-PAGE分析发现海州香薷根、叶的部分蛋白条带的亮度稍有上调。进一步对根叶的蛋白质组研究发现,根系有79个蛋白点的表达发生变化,其中49个上调,30个下调;叶部有14个蛋白点的表达发生变化,上调9个下调5个。对根系蛋白进行GO分析表明,这些蛋白具有多种分子功能,参与多个生物学过程,说明海州香薷对Cu的吸收过程同样具有复杂的分子机制。根系差异表达蛋白主要参与淀粉代谢、信号转导、氧化还原动态平衡调控、转录与翻译调控、能量代谢调控、蛋白质的修饰、降解与转运、疾病抗性、细胞壁代谢与细胞骨架调控等过程;叶部差异表达蛋白主要参与液泡离子转运、能量代谢和碳同化,另外Rubisco蛋白降解比较明显。这些蛋白质组学数据展示了海州香薷通过改变体内生化反应和代谢途径来适应缺Cu胁迫的分子机理。对海州香薷高铜和缺铜胁迫时根、叶的蛋白质组学研究结果表明根系在Cu的吸收耐性与解毒机制中具有重要的意义,可能起到Cu库的作用。海州香薷适应缺铜和高铜胁迫时,能够诱导一些类似功能的蛋白,诸如氧化还原调控、信号转导、转录与翻译调控、能量代谢调控、细胞壁代谢与细胞骨架调控、离子转运等相关的蛋白,但这些蛋白在两种胁迫时处理Cu离子的机理不尽相同。5、海州香薷高Cu、缺Cu胁迫根cDNA文库的构建本研究分别以缺铜和高铜处理3h、6h和24h的海州香薷根尖为建库材料,采用SMART技术首次构建了海州香薷缺铜和高铜胁迫的cDNA文库。缺铜胁迫cDNA原始文库滴度为1.22E+08 pfu/mL,文库所含独立克隆数为6.41E+07个,扩增文库滴度为3.96E+12 pfu/mL,重组率为98%,插入片段82%大于500bp。高铜胁迫cDNA原始文库滴度为3.44E+07pfu/mL,文库所含独立克隆数为1.81E+07个,扩增文库滴度为4.86E+12 pfu/mL,重组率为99%,插入片段79%大于500bp。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物对土壤重金属的吸收与累积机理
• 1.1.1 植物可吸收的重金属形态
• 1.1.2 植物对根际土壤重金属的活化
• 1.1.3 植物对重金属的吸收
• 1.1.4 重金属在植物体内的转运
• 1.1.5 重金属在植物体内的分配与贮存
• 1.1.6 重金属跨膜转运的吸收累积机制
• 1.2 植物对重金属的耐性与解毒机理
• 1.2.1 细胞壁与重金属结合
• 1.2.2 重金属的外排
• 1.2.3 重金属的区室化作用
• 1.2.4 对重金属的络合作用
• 1.2.5 重金属耐性相关蛋白
• 1.3 植物对Cu的吸收解毒机理研究进展
• 1.3.1 植物对Cu的吸收
• 1.3.2 铜在植物体内的转运
• 1.3.3 铜缺乏对植物的影响
• 1.3.4 铜过量对植物的毒害
• 1.3.5 铜污染土壤的植物修复
• 1.4 转录组学及其在环境科学中的研究进展
• 1.4.1 cDNA-AFLP技术原理与方法
• 1.4.2 cDNA-AFLP技术特点
• 1.4.3 cDNA-AFLP技术及其在环境科学中的应用
• 1.5 蛋白质组学及其在环境科学中的研究进展
• 1.5.1 蛋白质组学的概念
• 1.5.2 蛋白质组学的研究方法和技术手段
• 1.5.2.1 蛋白质组学的研究方法
• 1.5.2.2 蛋白质组学的技术手段
• 1.5.3 蛋白质组学在环境科学中的应用研究进展
• 1.5.3.1 环境蛋白质组学研究简要的发展过程
• 1.5.3.2 微生物的环境蛋白质组学研究
• 1.5.3.3 植物的环境蛋白质组学研究
• 1.5.3.4 水生物的环境蛋白质组学研究
• 1.5.3.5 无脊椎生物的环境蛋白质组学研究
• 1.5.4 展望
• 1.6 cDNA文库
• 1.6.1 cDNA文库的种类
• 1.6.2 SMART法构建全长cDNA文库
• 1.6.3 cDNA文库质量的评价
• 1.7 论文立题依据和研究内容
• 1.7.1 立题依据
• 1.7.2 研究内容
• 1.7.3 技术路线
• 1.7.4 创新点
• 第二章 海州香薷Cu调节基因的转录组学分析
• 引言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 所用主要试剂和培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 海州香薷材料准备
• 2.2.1.1 海州香薷培养
• 2.2.1.2 海州香薷胁迫处理
• 2.2.1.3 取样
• 2.2.2 海州香薷总RNA的提取
• 2.2.3 总RNA检测
• 2.2.4 mRNA纯化
• 2.2.5 cDNA-AFLP
• 2.2.5.1 第一链cDNA合成
• 2.2.5.2 第二链cDNA合成:采用LD-PCR扩增法
• 2.5.5.3 用QIAquick PCR Purification Kit纯化双链cDNA
• 2.2.5.4 cDNA酶切
• 2.2.5.5 连接反应
• 2.2.5.6 预扩增
• 2.2.5.7 选择性扩增
• 2.2.5.8 测序胶电泳
• 2.2.5.9 测序胶银染
• 2.2.5.10 DNA-AFLP差异片段的克隆
• 2.2.6 序列比较及基因功能分析
• 2.2.7 cDNA-AFLP片段的Real Time-PCR验证
• 2.2.7.1 实时荧光定量PCR引物与荧光探针合成
• 2.2.7.2 Real Time-PCR模板准备
• 2.2.7.3 Real Time-PCR反应
• 2.2.7.4 Real Time-PCR结果处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA的分离和质量检测
• 2.3.2 cDNA-AFLP
• 2.3.2.1 ds-cDNA的合成
• 2.3.2.2 预扩增产物检测
• 2.3.2.3 选择性扩增产物检测
• 2.3.2.4 选择性扩增差异条带的回收克隆与测序鉴定
• 2.3.2.5 差异条带序列分析与比较
• 2.3.3 TDF的实时荧光定量PCR验证
• 2.3.4 Cu诱导基因的表达模式
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 海州香薷Cu调节蛋白的蛋白质组学分析
• 引言
• 3.1 海州香薷双向电泳技术的研究
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 植物材料准备
• 3.1.1.2 实验仪器及试剂
• 3.1.1.3 实验前的准备工作
• 3.1.1.4 蛋白质的提取方法
• 3.1.1.5 蛋白样品制备
• 3.1.1.6 Bradford法蛋白定量
• 3.1.1.7 总蛋白的纯化
• 3.1.1.8 固相pH梯度双向凝胶电泳（IPG-2D-PAGE）
• 3.1.1.9 银染（Yan et al.2000）
• 3.1.1.10 图像采集与分析
• 3.1.2 结果与分析
• 3.1.2.1 海州香薷蛋白提取方法筛选
• 3.1.2.2 IPG（Immobilized pH gradeient）胶条pH值的选择
• 3.1.3 讨论
• 3.1.4 小结
• 3.2 海州香薷高铜胁迫下的蛋白质组研究
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 植物材料准备
• 3.2.1.2 实验仪器、试剂及实验准备工作
• 3.2.1.3 海州香薷铜含量的测定方法
• 3.2.1.4 海州香薷蛋白提取纯化方法
• 3.2.1.5 SDS-PAGE电泳
• 3.2.1.6 考马斯亮兰染色
• 3.2.1.7 固相pH梯度双向凝胶电泳
• 3.2.1.8 银染
• 3.2.1.9 图像采集与分析
• 3.2.1.10 蛋白的胶内胰酶消化
• 3.2.1.11 质谱鉴定
• 3.2.1.12 数据库的搜索和蛋白质的鉴定
• 3.2.2 结果与分析
• 3.2.2.1 海州香薷对铜的吸收
• 3.2.2.2 海州香薷根、叶铜胁迫蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.2.2.3 铜胁迫处理条件下海州香薷根、叶蛋白的2-DE分析
• 3.2.2.4 根系差异蛋白的基因本体论分析
• 3.2.3 讨论
• 3.2.4 小结
• 3.3 海州香薷缺铜胁迫下的蛋白质组研究
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.1.1 植物材料准备
• 3.3.1.2 其它方法见3.2。
• 3.3.2 结果与分析
• 3.3.2.1 海州香薷缺Cu处理时根叶的铜含量
• 3.3.2.2 海州香薷根、叶铜胁迫蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.3.2.3 缺铜胁迫处理条件下海州香薷根、叶蛋白的2D-PAGE分析
• 3.3.2.4 根系差异蛋白的基因本体论分析
• 3.3.3 讨论
• 3.3.4 小结
• 3.4 总结
• 第四章 海州香薷缺Cu和高Cu胁迫根cDNA文库的构建
• 引言
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 所用主要试剂和培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 海州香薷材料准备
• 4.2.1.1 海州香薷培养
• 4.2.1.2 海州香薷胁迫处理
• 4.2.1.3 取样
• 4.2.2 海州香薷总RNA的提取
• 4.2.3 总RNA检测
• 4.2.4 mRNA纯化
• 4.2.5 cDNA文库构建
• 4.2.5.1 第一链cDNA合成
• 4.4.5.2 第二链cDNA合成
• 4.2.5.3 蛋白酶K消化
• 4.2.5.4 限制性内切酶Sfi Ⅰ消化双链cDNA
• 4.2.5.5 用CHROMA SPINTM-400对cDNA进行分级分离
• 4.2.5.6 cDNA与载体λTripIEx2的连接
• 4.2.5.7 连接产物的包装
• 4.2.6 cDNA文库质量鉴定
• 4.2.6.1 文库滴度测定
• 4.2.6.2 文库插入片段大小以及重组率
• 4.2.7 原始文库的扩增与保存
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 总RNA的分离和质量检测
• 4.3.2 cDNA文库构建及质量检测
• 4.3.2.1 ds-cDNA的合成
• TM-400分级'>4.3.2.2 链cDNA的CHROMA SPIN^TM-400分级
• 4.3.2.3 cDNA与载体λTripIEx2的连接效率及文库滴度测定
• 4.3.2.4 cDNA文库插入片段大小及重组率
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 主要研究结论与展望
• 5.1 主要研究结论
• 5.1.1 海州香薷对缺铜、高铜胁迫的转录组学研究
• 5.1.2 海州香薷对缺铜、高铜胁迫的蛋白质组学研究
• 5.1.2.1 海州香薷双向电泳技术的研究
• 5.1.2.2 海州香薷高铜胁迫下的蛋白质组学研究
• 5.1.2.3 海州香薷缺铜胁迫下的蛋白质组学研究
• 5.1.2.4 小结
• 5.1.3 海州香薷缺铜、高铜胁迫全长cDNA文库的构建
• 5.2 主要创新点
• 5.3 研究展望
• 参考文献
• 图目录
• Index of figures
• 表目录
• Index of tables
• 附攻读博士期间发表及撰写的文章