重组蛛丝蛋白支架材料生物相容性的研究

论文摘要

重组蛛丝蛋白作为一种新型的生物材料在组织工程领域得到广泛关注。利用本室先期已构建含有细胞黏附位点RGD的基因工程菌pNSR-32/BL21（DE3）pLysS进行高密度发酵,建立适合pNSR-32基因工程菌表达蛋白的纯化方法。确定的最终纯化方案为:按1:5（m/v）的比例混悬湿菌体和磷酸盐缓冲液,70%功率冰浴超声10min,脉冲9s,脉停2s。80℃加热超声液10min,调节pH至5.5。离心,上清用15%饱和度硫酸铵溶液沉淀1.5h,调上清液pH至蛋白等电点6.5。离心后收集沉淀,透析冻干保存。按上述方法进行纯化,目的蛋白纯度达到85%以上,得率约在1.5～2.5mg/g湿菌体。将纯化的重组蛛丝蛋白作为原料,按本室所建立的方法制备支架材料,评价其细胞相容性。采用MTT的方法讨论重组蛛丝蛋白支架材料的细胞毒性,并通过NIH-3T3细胞与支架材料复合培养研究支架材料对细胞黏附、生长和分化的影响。MTT实验结果表明,重组蛛丝蛋白支架材料浸提液对NIH-3T3细胞的生长和增殖影响较小,根据细胞毒性实验毒性评定标准,判定重组蛛丝蛋白支架材料毒性等级在1级以下,符合合格生物材料的要求。电子扫描电镜（SEM）和常规HE染色观察发现,含有RGD三肽的重组蛛丝蛋白支架材料更利于NIH-3T3细胞黏附,细胞在材料表面形成多层结构且深入材料内部生长。碱性成纤维生长因子（bFGF）免疫组化实验结果说明复合培养的NIH-3T3细胞可以表达bFGF因子。通过建立大鼠背部深度烫伤模型,研究重组蛛丝蛋白支架材料—细胞复合物对深度烫伤创面愈合的影响。用pNSR-16和pNSR-32两种材料与NIH-3T3细胞复合物修复烫伤创面,两者的羟脯氨酸含量均高于其余各组。HE染色结果显示,在创面愈合初期,pNSR-16和pNSR-32两种材料与细胞复合物的创面修复情况比其余各组活跃。免疫组化结果发现,bFGF因子在细胞增殖活跃的创面修复部位均有较高表达,pNSR-16和pNSR-32两种材料与细胞复合物组比其余组表达bFGF明显。以上结果初步表明,重组蛛丝蛋白支架材料—细胞复合物组优于单纯材料组和烫伤对照组,对促进深度烫伤创面愈合有一定作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 生物材料与组织工程
• 1.1.1 组织工程支架材料的制备与评价方法
• 1.1.2 细胞与生物材料复合培养技术
• 1.1.3 丝素材料在组织工程上的研究进展
• 1.2 蜘蛛丝的研究概况
• 1.3 皮肤创面修复的研究概况
• 1.3.1 烧伤创面修复过程与评价
• 1.3.2 皮肤敷料材料
• 1.3.3 组织工程化皮肤
• 1.3.4 皮肤创面修复材料的研究进展
• 1.4 本研究的背景、主要内容及意义
• 1.4.1 本研究的背景
• 1.4.2 本研究的主要内容
• 1.4.3 本研究的意义
• 第2章 pNSR-32/BL21（DE3）pLysS基因工程菌表达重组蛛丝蛋白的规模化分离纯化研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 常用溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 超声破碎细胞
• 2.2.2 重组蛛丝蛋白纯化条件
• 2.2.3 规模化纯化
• 2.2.4 蛋白质纯度与浓度测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 超声破碎细胞
• 2.3.2 加热对重组蛋白纯化的影响
• 2.3.3 pH对重组蛋白纯化的影响
• 2.3.4 硫酸铵饱和度对重组蛋白纯化的影响
• 2.3.5 小量纯化验证实验
• 2.3.6 规模化纯化
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第3章 重组蛛丝蛋白支架材料的细胞相容性
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 常用溶液
• 3.2 方法
• 3.2.1 支架材料的制备
• 3.2.2 细胞培养与保存
• 3.2.3 MTT实验
• 3.2.4 体外细胞毒性实验
• 3.2.5 细胞与支架材料复合培养
• 3.2.6 检测方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 支架材料制备
• 3.3.2 培养细胞的特性
• 3.3.3 体外细胞毒性实验
• 3.3.4 细胞与重组蛛丝蛋白支架材料复合培养
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第4章 重组蛛丝蛋白材料—细胞复合物在烫伤修复中的初步应用
• 4.1 材料
• 4.1.1 细胞株
• 4.1.2 支架材料
• 4.1.3 实验动物
• 4.1.4 主要试剂
• 4.1.5 主要仪器和器械
• 4.2 方法
• 4.2.1 支架材料制备
• 4.2.2 细胞与支架材料复合培养
• 4.2.3 建立烫伤模型
• 4.2.4 动物实验
• 4.2.5 检测方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 细胞与支架材料复合培养结果
• 4.3.2 建立烫伤模型结果
• 4.3.3 烫伤修复实验过程
• 4.3.4 大体观察结果
• 4.3.5 羟脯氨酸含量测定结果
• 4.3.6 HE染色结果
• 4.3.7 免疫组化结果
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历