论文摘要
细胞色素P450酶系义称作多功能氧化酶（MFO）,是广泛存在于所有需氧生物体中的一类代谢酶系,细胞色素P450基因起源于35亿年前的一个共同祖先,是最古老和最庞大的超基因家族之一,在生命的过程中,它对内源物质的代谢与转化或外源化合物的活化与降解等进行催化和调控。在昆虫基因组中大约有100个左右的P450s,它们的作用涉及生长、发育、取食等过程,其对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对植物有毒物质的耐受性,它还参与了昆虫体内保幼激素、蜕皮激素和脂肪酸等内源化合物的合成与代谢。家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目昆虫的模式生物,鳞翅目是昆虫中的第二大目,其中许多是极具危害性的农业害虫。随着生物技术的发展,家蚕已经成为一个重要的生物反应器用于生产重组蛋白。鳞翅目昆虫基因组信息不但对蚕丝业的改良产生了重大影响,而且也促进了新的害虫防治技术的发展。本研究基于家蚕基因组精细图和EST、全基因组基因芯片数据,对家蚕细胞色素P450基因进行了生物信息学及比较基因组学研究,开展了其中CYP9A基因簇的结构与进化分析,采用RNAi技术对家蚕中被推定为蜕皮激素C26-羟基化酶的直向同源基因CYP18A1进行了功能研究。本论文的主要研究结果如下:1.家蚕细胞色素P450基因的基因组学分析将人、拟南芥、果蝇及盘基网柄菌等其它24个物种中已知的P450s在家蚕基因组精细图数据库中进行同源检索分析,以鉴定家蚕细胞色素P450基因。结果显示,家蚕基因组中存在84个细胞色素P450基因,其中有78个功能基因,6个假基因,并发现其中有8个基因簇的存在,最大的基因簇包含有9个P450s。假基因和基因簇的存在均属首次报道。首次绘制了家蚕P450s的基因图谱,其中80个P450s可定位到19条不同的染色体上。此次首先报道的6个假基因,包括2个基因缺失突变,3个因片段滑移而产生阅读框内的移码突变,1个基因碎片。它们主要分布于基因数量大量扩增的Clan3和Clan4,而且有5个位于基因簇中,这充分显示了它们与基因复制的直接联系。通过对预测P450s序列延伸,获得了70个具有完全开放阅读框的功能基因全长序列。并根据预测序列建立了系统发生树,将它们按昆虫P450集团、家族、亚家族分类,78个功能基因可分为26个家族,47个亚家族。提交国际细胞色素P450委员会后被分别予以正式命名。84个预测基因有40个基因至少有1条EST序列为其表达证据。其中,来自Clan2和线粒体集团的P450s有EST证据的比例要明显高于其它2个集团,说明这些基因对家蚕正常的发育变态至关重要。家蚕全基因组芯片数据分析表明不同家蚕P450s之间具有组织和时期表达的差异性与特异性,未表达基因应更具昆虫P450s的诱导表达特点。本研究还首次利用wise2程序对每个预测家蚕P450s进行内含子-外显子结构的分析,绘制了首张全基因组家蚕P450s结构图,通过它们的系统发生关系分析得知,基因结构和系统发生关系之间总体上存在紧密联系,即:进化关系越近,基因结构越相似,进化关系越远,基因结构差异越大。2.昆虫P450s的比较基因组学分析果蝇是目前昆虫P450s功能研究得最为清楚的模式昆虫,它和家蚕分别作为双翅目与鳞翅目昆虫的代表,P450s的数量也基本相当。通过利用这2种昆虫的功能基因建立系统发生树,发现了2物种间存在10对直向同源基因,但在基因数量大量扩增的Clan3与Clan4中,已很难找出直向同源基因,这2个集团基因在进化树的进化枝上表现出了种属特异性,即:在独立的进化枝上聚合的基因绝大多数是来自同一昆虫。我们推测这些基因在不同种类昆虫中的分化,是为了应对昆虫各自不同的生存环境与取食对象的选择压力所致。此外,在家蚕和果蝇的P450功能基因在Clan3与Clan4的数量和种类分布上存在明显差异,推测家蚕等鳞翅目昆虫可能没有像果蝇等双翅目昆虫那样对有毒物质的强代谢能力,替而代之是更多地依赖于多样选择和增强反防御能力等主动防御方式来提高自身对环境的适应能力。通过比较基因组学方法,研究发现直向同源基因CYP18A1和CYP306A1在家蚕、果蝇与蜜蜂中存在线性保守,其基因位置与结构的同源性。暗示了它们功能上的相似性。首次根据果蝇、蜜蜂与家蚕P450s内含子-外显子结构,按不同集团的划分对来自3种不同昆虫的P450s进行了基因结构的比较分析。结果发现这些基因中存在大量的特异性内含子,在家蚕和蜜蜂中存在0相跨集团保守内含子,但在3个昆虫中均存在的跨集团保守内含子是1相内含子,这些实际观察到的情况还不能很好回答内含子起源的问题。横向同源基因大量扩增,进化最迅速,功能多样,表现出环境应答基因特点的Clan3基因虽然由昆虫特有的P450s所组成,分化时间在3亿年以内,但跨不同昆虫的保守内含子最少。而在功能保守的Clan2和线粒体集团,特别是线粒体集团,则存在数量较多的跨昆虫保守内含子;从线虫、人与昆虫的P450s比较来看,尽管它们的分化时间已超过7亿年,仍然在这2集团中存在一定数量的保守内含子,说明这些功能保守的基因虽然在氨基酸序列保守性方面发生了明显的差异,已不属于同一家族的基因,但与功能相关的结构域仍然高度保守,导致了编码该保守序列的DNA结构即形成的内含子与外显子的结构保守性也很高。果蝇、蜜蜂与家蚕的基因组大小分别为132Mb、262Mb和432Mb。果蝇P450s的内含子数量最少,大小最小,家蚕的内含子数量最多,大小最大,蜜蜂则居于其中,这刚好和这3种昆虫基因组大小相一致。表明随着基因组增大,基因的内含子含量也随之增多。3.家蚕CYP9A基因簇基因的克隆与复制机制研究通过RT-PCR方法,克隆得到了家蚕4个CYP9A基因,分别被国际P450委员会命名为CYP9A19,CYP9A20,CYP9A21,CYP9A22。它们具有完全相同大小的开放阅读框,均有9个内含子,10个外显子,内含子的插入位点与相位完全保守。3个同转录方向的基因串联重复,而另1个反方向转录的基因被4个串联的乙醇脱氢酶基因所间隔而位于同一Scaffold的下游,呈现出明显的基因重复的结构特征,这是关于家蚕细胞色素P450s基因簇的第一个报道。同源性分析表明,家蚕CYP9As和已分离的昆虫CYP9As有很高的序列相似性,而且和美国棉铃虫的CYP9A12v3和CYP9A14具有完全保守的内含子插入位点,所对应的各外显子长度几乎完全相同。昆虫CYP9As的系统进化分析表明,家蚕的4个CYP9As是由3次不同的复制事件而来。其中,CYP9A22和棉铃虫的CYP9A14的同源性超过了和家蚕本身CYP9As的同源性,应是最古老的基因,CYP9A19和CYP9A21的序列相似性超过了94%,而且5’端旁侧序列也存在相当高的同源性,应是最近基因复制事件的产物。从家蚕CYP9A基因的表达分析来看,这4个基因均选择性地在外源化合物进入蚕体的主要入口组织脂肪体、中肠及体壁中表达,表明它们可能与异生性化合物代谢有关,同时它们也在其他组织和器官中表达,推测它们参与了内源性物质调节。通过4个基因间的特异性表达方式和它们系统发生关系表明,基因复制发生时间与基因的表达分化之间存在相当紧密的相关关系。即:分化时间越远则表达筹异越大。4.家蚕CYP18A1的克隆与功能研究蜕皮激素对昆虫生长、发育和繁殖有重要调控作用,尤其对蜕皮和变态过程。根据信息分析的结果,我们克隆了家蚕中被推定为蜕皮激素C26羟基化酶的直向同源基因CYP18A1,该基因包括5’-UTR在内有1737bp,编码541个氨基酸,在GenBank上的对应登录号为EF421988。它和已经分离的其它物种的直向同源基因,特别是海灰翅夜蛾的有较高的同源性。在和包括哺乳动物中与类固醇合成和代谢有关P450s在内的基因进行系统发生关系分析时发现,哺乳动物中与类固醇代谢有关的CYP2基因和家蚕CYP18A1有较为相近的进化关系,这可能暗示着与甾类化合物代谢相关基因在远源物种分化后,仍保持着序列与功能的保守性。无论表达谱分析还是家蚕全基因组芯片数据均表明该基因在上簇第2天有相对较高的转录水平,与家蚕体内相应的蜕皮激素峰值时间有很高的一致性,从而进一步印证了以前的研究对该昆虫直向同源基因功能的推断,即蜕皮激素应一样参与了家蚕的CYP18A的转录调控,该基因与家蚕蜕皮激素代谢也可能有一定的关系。结合组织、时间表达谱分析,以体外注射的方式,通过在5龄中后期及老熟前期连续向蚕体导入体外合成的CYP18A1对应的dsRNA,获得了发育偏快的表型。说明家蚕CYP18A1基因可能与家蚕的发育变态相关。该基因功能的发现和进一步深入研究可会为昆虫害虫防治提供新的作用靶标和控制策略。