果蝇硒蛋白dSelK与细胞中钙离子浓度变化的关系研究

论文摘要

硒蛋白是生物体内通过终止密码子之一的UGA编码的一种特异蛋白质,已经阐明生物功能的硒蛋白在生物体内都有重要的生理功能。果蝇硒蛋白dSelK是果蝇体内已知的三种硒蛋白之一,并且是唯一一种位于内质网中的硒蛋白,阐明其生物功能对于研究动物的生理代谢具有重要作用。本课题组在前期研究中通过基因芯片检测发现当果蝇细胞Schneider 2（S2）的dSelK通过dsRNAi敲减后位于内质网上与钙离子转运相关的Inositol 1,4,5,-tris-phosphate receptor （IP3 receptor）的表达量发生显著的降低,而和其功能相反的位于细胞浆中的Inositol 1,4,5,-tris-phosphate Kinase1 （ IP3 Kinase1）的表达量发生显著升高,由此初步推测dSelK可能与内质网内中钙离子的释放有关。本实验首先通过实时定量PCR对于前期所进行的基因芯片检测结果进行了验证。然后利用dsRNAi对果蝇细胞S2细胞中dSelK的mRNA进行敲减,对dSelK敲减获得果蝇S2细胞浆中游离钙离子浓度的变化情况用钙离子荧光探针Fluo-3/AM和激光共聚焦显微镜进行了检测,同时构建dSelK与红色荧光蛋白dsRed融合蛋白的表达质粒pAC-dSelK-dsRed-N1,并将其在果蝇S2细胞中表达,利用钙离子荧光探针Fluo-3/AM和激光共聚焦显微镜对胞浆内游离钙离子的变化情况进行了检测。通过Hoechest染色等方法对dSelK过表达时细胞凋亡的情况进行研究。实时定量PCR研究表明,当果蝇细胞中dSelK的mRNA被dsRNAi敲减后,位于内质网上促进内质网中钙离子向细胞浆中释放的IP3 receptor的表达量显著下降,而位于细胞浆中与IP3 Receptor功能相反的IP3 Kinase1的表达量显著升高,进一步证实了本课题组前期基因芯片检测的研究结果。对dsRNAi后果蝇S2细胞浆中游离钙离子的研究发现,在dSelK的mRNA被dsRNAi敲减后细胞浆中的钙离子浓度显著降低。对dSelK-dsRed融合蛋白过表达的果蝇S2细胞浆中游离钙离子浓度的研究发现,在dSelK过表达后,果蝇细胞浆中的钙离子浓度与空白对照正常细胞相比显著升高,而其阴性对照内质网结构蛋白PDI过表达的细胞胞浆中的钙离子浓度没有明显变化。通过Hoechest等进行的细胞凋亡检测没有在dSelK的过表达果蝇S2细胞中发现凋亡现象。综上所述,本实验通过对dsRNAi基因敲减果蝇S2细胞和dSelK过表达果蝇S2细胞浆中钙离子浓度变化的测定首次发现果蝇硒蛋白dSelK能够通过控制位于内质网中的钙离子向细胞浆中的释放,并且这种释放有可能是通过提高位于内质网上的IP3 Receptor的表达而实现的。上述研究对于揭示其人体内同源基因人硒蛋白SelK及生物体中其他硒蛋白的生物功能具有重要的指导意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 硒与硒蛋白
• 0.2 果蝇硒蛋白
• 0.3 硒蛋白的定位与相关功能
• 0.4 果蝇硒蛋白的定位及功能
• 第1章 实时定量 PCR 方法对 RNA 干扰dSelK 基因芯片结果的验证
• 1.1 实验方案
• 1.2 实验材料
• 1.3 实验方法
• 1.4 实验结果
• 1.5 讨论分析
• 第2章 果蝇 S2 细胞中过表达dSelK 后检测胞浆内钙离子浓度变化
• 2.1 实验方案
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 实验结果
• 2.5 讨论分析
• 第3章 RNA 干扰dSelK 后检测胞浆内钙离子浓度变化
• 3.1 实验方案
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.4 实验结果
• 3.5 讨论分析
• 第4章结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况