基因枪法和农杆菌—花器浸蘸法将CYCD2基因导入小麦的研究

论文摘要

CycD2是一种植物细胞周期相关蛋白基因，Cockcroft（2000）等将CycD2基因转入烟草中发现，转基因烟草中CycD2表达量的增加导致细胞分裂速率加快，同时转基因植株地上部的生长速率也比对照加快一倍。目前还尚未见有将CycD2基因导入小麦的相关报道。本研究采用基因枪法和农杆菌花器浸蘸法将CycD2基因导入小麦，主要研究结果如下：在本实验室王小霞（2006）工作基础上，对通过基因枪法获得的转基因植株（MY11-CycD2）T1代进行了分子生物学检测，PCR检测结果表明只有部分后代植株含有转化的CycD2基因片段，而Southern-blot鉴定结果表明CycD2基因在T1代中没有整合到小麦核基因组中：对转基因植株T2代进行农艺性状调查发现：大部分T2代转基因植株株型正常，能够正常结实尽管植株感白粉病的现象较为严重，但转基因植株间植株高度有较大差异，其中有4个转基因植株的株高比其它正常植株矮10cm左右并且观察到穗颈长度有明显缩短，多重比较结果显示T2代转基因植株间植株高度差异已达到显著水平。在运用农杆菌花器浸蘸法将CycD2基因导入小麦的过程中，主要对菌液接种方法进行了一些改进和比较，确定了合适的遗传霉素（G418）筛选浓度并且获得25个抗性植株，但PCR检测未能扩增出特异性条带；而对T1植株的农艺性状考察结果发现：大部分植株的生长发育与报道的一些转基因植株的情况比较类似，其中还观察到了有一些植株的部分叶片呈现出无规卷曲，还有一些植株的穗颈长度也出现明显缩短的情况。推测出现这种现象的原因可能是由于栽培环境条件所引起的植株生理性异常，也有可能是农杆菌液浸蘸过程或外源DNA整合过程中发生变异所引起的遗传性异常，目前具体原因还有待进一步的研究来确认。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 小麦转基因研究现状与发展趋势
• 1.1 现有的小麦遗传转化方法
• 1.1.1 基因枪法
• 1.1.2 农杆菌介导法
• 1.1.3 花粉管通道法
• 1.1.4 其它转基因方法
• 1.2 转化细胞的筛选
• 1.3 现今在小麦上转化成功的目的基因
• 1.4 转基因技术存在的问题
• 1.5 小麦转基因研究展望
• 2 D型植物细胞周期蛋白基因研究进展
• 2.1 植物细胞周期蛋白基因
• 2.2 依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（CDKs）基因
• 2.3 其他相关的基因
• 2.4 D型植物细胞蛋白基因及其转基因研究进展
• 3 研究目的和意义
• 第二章 基因枪法获得CycD2转基因植株及对其后代的研究
• 1 CycD2转基因植株的获得
• 1.1 植物材料
• 1.2 培养基
• 1.3 转化质粒
• 1.4 小麦成熟胚离体培养
• 1.5 基因枪转化与G418抗性筛选
• 0代分子鉴定'>1.6 小麦转基因植株 T₀代分子鉴定
• 0代的获得'>1.7 小麦转基因植株 T₀代的获得
• 2 对CycD2转基因后代的研究
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 叶片总DNA的提取:SDS法
• 1代 PCR检测'>2.2.2 小麦转基因植株 T₁代 PCR检测
• 1代 Southern-blot鉴定'>2.2.3 小麦转基因植株 T₁代 Southern-blot鉴定
• 2.3 时间安排
• 2.4 结果与分析
• 1代 PCR检测'>2.4.1 小麦转基因植株 T₁代 PCR检测
• 1代 Southern-blot鉴定'>2.4.2 小麦转基因植株 T₁代 Southern-blot鉴定
• 2.4.3 小麦转基因植株后代农艺性状分析
• 2.5 讨论
• 第三章 农杆菌花器浸蘸法在小麦转化中的应用研究
• 1 材料和方法
• 1.1 小麦受体材料准备
• 1.2 培养基
• 1.3 工程菌株的构建和鉴定
• 1.4 农杆菌菌株的活化与保存
• 1.4.1 菌株的短期保存
• 1.4.2 菌株的长期保存
• 1.4.3 接种菌液的制备
• 1.5 接种方法
• 1.5.1 花器滴注法接种
• 1.5.2 针刺注射法接种
• 1代种子进行G418抗性筛选'>1.6 对 T₁代种子进行G418抗性筛选
• 1.7 抗性植株PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 工程菌株的菌落PCR法鉴定
• 1代种子外观形态的影响'>2.2 菌液处理对 T₁代种子外观形态的影响
• 2.3 G418抗性筛选
• 2.4 菌液接种方式对转化效率的影响
• 2.5 抗性植株PCR检测
• 2.6 抗性植株农艺性状观察
• 3 讨论
• 3.1 影响农杆菌花器浸蘸转化效率的一些因素
• 3.2 转化体的筛选和鉴定
• 参考文献
• 附录
• 致谢