小麦籽粒硬度基因RNAi表达载体构建

论文摘要

小麦籽粒硬度是决定小麦磨粉品质的最主要因素,能够影响小麦的终用途及其在国际贸易中的价格。从分子水平上说,小麦籽粒硬度主要由位于染色体5D上两个基因Puroindoline a和b（PinA和PinB）所决定,Pin基因的功能研究和转基因应用对小麦品质改良具有重要意义。六倍体小麦（AABBDD）由于存在野生型的Pin基因,籽粒通常表现为“软质”。目前愈来愈多的研究推测PINA和PINB在决定籽粒硬度过程中,可能以协同作用的方式发挥作用,并且一些最新研究显示两者可能存在相互作用。利用RNAi技术——这种能够特异性地引起单个基因发生转录后水平的沉默的技术——分别抑制PINA和PINB蛋白的表达对研究它们的生物学功能,以及创制六倍体中的硬质小麦种质都具有重要意义。本研究在构建能够特异地引发PinA基因RNAi的载体方面进行了探索。RNAi载体所需的元件——能够反向互补PinA基因正向序列和反向序列以及用于连接两者的内含子——都通过PCR来获得。在PCR引物设计中,引入了Bam HⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ、SacⅡ四个酶切位点,通过双酶切按顺序将PinA基因的正向序列、内含子和反向序列连接在一起。然后再通过SmaⅠ和SacⅠ的双酶切定向的将这个发夹结构连接到含有Ubi-1启动子的小麦表达载体p AHC25中。该RNAi载体在Ubi-1启动子的驱动下,广谱表达PinA基因的双链发夹结构RNA,从而引起PinA基因的基因沉默。这为利用RNAi技术研究小麦中PinA、PinB的生物学功能和它们在影响籽粒硬度过程中的相互关系,以及利用Pin基因沉默得到六倍体硬质小麦转基因品系提供了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 小麦磨粉品质的分子基础
• 1.2 植物中转录后基因沉默的研究及应用
• 1.3 本课题的研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因受体L88-31中PIN蛋白的提取及鉴定
• 3.2 PinA 和 PinB 基因中用于RNAi 载体构建的序列的选择
• 3.3 p AHC25 载体的验证
• 3.4 p MD18-T 载体酶切验证
• 3.5 PinA正反向序列，PinB 正反向序列以及TAK 内含子的扩增及鉴定
• 3.6 中间载体构建及分析
• 4 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 主要研究结果
• 5.2 有待继续开展的工作
• 致谢
• 参考文献
• 附录 1
• 附录 3