草莓离体再生研究及plB基因siRNA表达载体构建

论文摘要

草莓（Fagaria ananassa Duch.）是世界上最重要的经济浆果之一,其新品种选育的主要途径是杂交育种,但由于草莓本身遗传性状的高度杂合和多倍性,使得常规育种费时费力、周期长,见效慢,而且目标性状与不良性状连锁,造成育种效率低,不能适应草莓生产发展的需要。植物基因工程的发展和应用为草莓育种开辟了一条新途径。由于农杆菌介导的遗传转化主要依赖于受体材料的再生能力及农杆菌的转化效率,因此,良好而高效的受体再生体系建立是进行成功的基因转化关键所在。本试验以草莓品种‘丰香’和‘红颊’为试材,研究了草莓离体再生过程中基因型、基本培养基、激素配比、暗培养以及硝酸银浓度对草莓离体再生不定芽的影响,获得了草莓的离体再生体系。果胶裂解酶（PL）基因与草莓果实成熟软化直接相关,试验以plB为靶目标,设计合成了siRNA寡核苷酸链,退火连接入植物双元表达载体pBI121中。主要研究结果如下:（1）草莓离体再生体系。本试验应用的植物生长调节剂组合中,‘红颊’较‘丰香’表现出较高的再生力,各自最佳诱导培养基及再生率为:‘红颊’为MS+6-BA 3.0mg/L+2,4-D 0.1 mg/L,不定芽再生率为56.4%;‘丰香’为MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.1mg/L,不定芽再生率为48.2%。6-BA、TDZ两种细胞分裂素在草莓叶片不定芽再生上的诱导结果表明,TDZ有利于诱导‘丰香’叶片不定芽再生,而对于‘红颊’,6-BA要好于TDZ。比较MS、MS+B5、B5三种基本培养基对草莓叶片不定芽再生的影响,‘红颊’和‘丰香’都对MS培养基较为敏感,不定芽表现良好且再生率较高,MS+B5和B5两种基本培养基不利于‘红颊’和‘丰香’叶片不定芽的分化。暗培养对‘红颊’和‘丰香’不定芽再生的效果相反:‘丰香’叶片不定芽再生有促进作用,最佳暗培养时间为14 d（不定芽再生率可提高到52.2%）,暗培养时间过长,不定芽有所下降,但抑制‘红颊’叶片不定芽再生。培养基中添加不同浓度AgNO3后,‘红颊’和‘丰香’叶片不定芽再生率都受到不同程度的抑制,且随着浓度的增大,抑制效应愈明显。（2） siRNA干涉表达载体的构建。利用Genbank中已知plB的mRNA基因序列（AF339024）,经Blast筛选,最后确定19个序列的编码碱基GCCTACAGGAAATGCCATG（即767-785）。siRNA发卡DNA退火后,电泳可见明亮条带位于约70bp处,与设计完全一致。植物双元载体pBI121经SacⅠ、BamHⅠ双酶切处理后,电泳鉴定切出1800bp和13kb大小两条片段。退火产物与回收的大片段连接,转化大肠杆菌DH5a,筛选得到重组子pBI121-PL,重组子经HindⅢ与BamHⅠ、HindⅢ与SacⅠ分别酶切后,通过酶切片段的大小,证明干涉表达载体构建成功。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第1章 前言
• 1 课题的提出
• 2 前人研究进展
• 2.1 草莓叶片培养
• 2.1.1 基因型
• 2.1.2 生理状态
• 2.1.3 基本培养基
• 2.1.4 植物生长调节剂
• 2.1.5 附加物
• 2.1.6 培养条件
• 2.2 果胶裂解酶
• 2.2.1 微生物中的果胶裂解酶
• 2.2.2 植物中果胶裂解酶基因的分子生物学
• 2.3 植物RNAi基因沉默研究进展
• 2.3.1 小RNA和基因沉默
• 2.3.2 sRNA介导的基因沉默机制
• 2.3.3 sRNA介导的基因沉默类型
• 2.3.4 基因沉默的优点和缺点
• 3 本研究的内容、目的与意义
• 第2章 草莓离体再生
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物激素
• 1.1.3 主要培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 叶片不定芽的诱导
• 1.2.2 培养条件
• 1.2.3 试验结果与数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 外植体接种后的形态变化
• 2.2 植物生长调节剂对草莓叶片再生不定芽的影响
• 2.2.1 6-BA对草莓叶片再生不定芽的影响
• 2.2.2 6-BA分别与2,4-D及NAA配比对草莓叶片再生不定芽的影响
• 2.2.3 不同浓度TDZ对草莓叶片再生不定芽的影响
• 2.2.4 TDZ与不同生长素组合对草莓叶片再生不定芽的影响
• 2.3 不同基本培养基对草莓叶片再生不定芽的影响
• 2.4 暗培养对草莓叶片再生不定芽的影响
• 2.5 硝酸银（AgNO3）对草莓叶片再生不定芽的影响
• 3 讨论
• 3.1 基因型对草莓不定芽再生的影响
• 3.2 植物生长调节剂对草莓叶片不定芽再生的影响
• 3.3 基本培养基和暗培养对草莓不定芽再生的影响
• 3.4 AgNO3对草莓不定芽再生的影响
• 第3章 PLB基因SIRNA表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 细菌材料
• 1.1.2 质粒材料
• 1.1.3 仪器设备和试剂
• 1.1.4 常用溶液及培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 目的基因的制备
• 1.2.2 干涉表达载体的构建
• 1.2.3 重组质粒酶切鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 编码shRNA的DNA序列设计结果
• 2.2 退火寡核苷酸的电泳结果
• 2.3 pBI 121质粒及其双酶切鉴定结果
• 2.4 重组质粒的酶切鉴定结果
• 3 讨论
• 3.1 RNA干扰试验中siRNA的设计及产生
• 3.2 RNA干扰试验中载体的选择
• 3.3 重组载体的构建及其鉴定分析
• 3.4 RNA干扰技术应用前景及其问题
• 4 进一步研究的内容
• 参考文献
• 致谢