一种侵染棉花黄萎病菌的双链RNA病毒研究

论文摘要

棉花黄萎病是世界上棉花作物的难治性病害。研究侵染棉花黄萎病菌的病毒将对病毒-黄萎病菌-棉花的互作关系,以及对棉花黄萎病菌的防治具有较大的潜在意义。本文对采集自陕西三原、渭南和大荔三个地区的11株致病力不同的棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）菌株进行dsRNA检测和分析。发现在弱致病力菌株0-21中有4条dsRNA条带存在。采用经改进的单引物扩增方法（M-SPAT法）获得4条dsRNA的全长cDNA克隆。DNA测序结果得到4条序列信息,根据片段大小依次命名为VcR1（3594 bp）、VcR2（3313 bp）、VcR3（2983bp）和VcR4（2932 bp）。核酸序列比对显示4条序列的5′-UTR与3′-UTR具有高度相似性,含有一致的末端序列,分别为5′-UGAUAAAAAA-3′和5′-UUUACUACU-3′。编码蛋白序列经BLAST-P检索结果显示, VcR1-4编码蛋白分别与Chrysovirus属病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）、外壳蛋白（CP）、未知功能蛋白和OTU蛋白酶（Ovarian Tumor protease）有较高同源性。两两序列比对结果显示:VcR1编码蛋白（1108 aa,127.5 kDa）与Chrysovirus属成员Cryphonectria nitschkei chrysovirus 1（CnV-1）、Penicillium chrysogenum virus （PcV）和Aspergillus fumigatus chrysovirus （AfuCV）编码的RdRp相似性较高,含有真菌病毒RdRp中8个高度保守的motif;VcR2编码蛋白（1016 aa,113.5 kDa）与CnV-1、AfuCV和PcV编码的CP相似性较高,前560个氨基酸序列有多个保守序列区域;VcR3编码蛋白（764 aa,84.1 kDa）与CnV-1-P4、AfuCV-P3和PcV-P3相似性较高,且与VcR1编码蛋白有一定同源性;VcR4编码蛋白（823 aa, 90.2 kDa）与CnV-1-P3、AfuCV-P4和PcV-P4相似性较高,并含有OTU蛋白的4个motif。系统进化树分析显示4条序列均与CnV-1、AfuCV和PcV具有较近的亲缘关系。对比Chrysovirus属成员基因组特征,从基因组结构、核酸序列和蛋白序列的比对及进化树分析等结果推测,4条dsRNA为Chrysovirus属的一种新病毒的基因组全序列。病毒粒子成球形,直径大小约为35nm。从病毒粒子样品中提取的基因组条带大小与菌株中提取的dsRNA大小一致;病毒基因组杂交进一步验证4条dsRNA为病毒性来源;SDS-PAGE检测结果与序列分析结果一致确认dsRNA2（VcR2）编码病毒的CP。综上所述,本研究第一次报道了侵染棉花黄萎病菌的一种新病毒全基因组序列及其病毒粒子特征,将该病毒暂命名为Verticillium dahliae chrysovirus 1,并对病毒介导弱毒株的可能性进行讨论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 棉花黄萎病菌研究进展
• 1.1 生物学特性
• 1.2 防治技术
• 2 植物病原真菌病毒研究进展
• 2.1 真菌病毒与弱毒株研究
• 2.2 产黄青霉病毒科研究现状
• 3 双链RNA 全序列克隆方法
• 3.1 单引物法
• 3.2 随机引物法
• 3.3 同源引物法
• 4 研究目的和内容
• 4.1 研究目的
• 4.2 研究内容
• 第二章 棉花黄萎病菌dsRNA 检测
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种来源
• 1.2 菌种培养与保存
• 1.3 酶与试剂
• 1.4 dsRNA 提取
• 2 结果与分析
• 3 小结与讨论
• 第三章 双链RNA 全长cDNA 克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 酶与试剂
• 1.3 dsRNA 纯化
• 1.4 dsRNA 序列克隆
• 1.4.1 M-SPAT 法序列扩增
• 1.4.2 cDNA 片段连接反应
• 1.4.3 重组质粒转化
• 1.4.4 碱法制备重组质粒DNA
• 1.4.5 重组质粒酶切鉴定
• 1.4.6 序列测定
• 2 结果与分析
• 2.1 cDNA 扩增结果
• 2.2 质粒提取与酶切鉴定
• 2.3 测序结果
• 3 小结与讨论
• 第四章 全长cDNA 序列分析与病毒特征鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种培养
• 1.2 酶与试剂
• 1.3 序列分析
• 1.4 病毒粒子提取与纯化
• 1.5 病毒粒子电镜观察
• 1.6 SDS-PAGE 检测外壳蛋白
• 1.7 从病毒粒子样品中提取基因组
• 1.8 基因组斑点杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 基因组序列分析
• 2.1.1 核苷酸序列分析
• 2.1.2 编码蛋白序列分析
• 2.2 病毒特征鉴定
• 2.2.1 病毒粒子电镜观察
• 2.2.2 SDS-PAGE 检测
• 2.2.3 病毒基因组提取结果
• 2.2.4 基因组斑点杂交
• 3 小结与讨论
• 总结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果