论文摘要
目的比较多种抗疟药作用后恶性疟原虫氯喹抗性株Fcc SM1/yN株pfcrt基因和pfmdr1基因在DNA水平和RNA表达水平上的差异,研究Fcc SM1/yN株对多种抗疟药敏感性差异的分子生物学基础,探讨抗性与药物作用相互关系的分子机制,为研发有效杀灭抗性恶性疟原虫的新药提供线索。方法（1）采用WHO推荐的Rieckmann体外微量法和巢式PCR-限制性片段长度多态性分析方法（PCR-RFLP）鉴定Fcc SM1/yN株是否为恶性疟原虫氯喹抗性株;确定氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、酮替芬和赛庚啶对Fcc SM1/yN株的IC50值,并进行酮替芬和赛庚啶提高体外培养的Fcc SM1/yN株对氯喹反应性的研究;（2）通过PCR扩增、巢式PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）等分子生物学方法研究氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、氯喹/酮替芬组合以及氯喹/赛庚啶组合作用后Fcc SM1/yN株pfcrt基因和pfmdr1基因在DNA水平上的差异。（3）通过RT-PCR方法和实时荧光定量PCR方法研究以上四种抗疟药以及两种抗疟药组合作用后Fcc SM1/yN株pfcrt基因和pfmdr1基因在转录水平上的差异。结果（1）体外微量法显示在氯喹32pmol孔依然有4～5个裂殖体形成,按照氯喹抗性标准判定Fcc SM1/yN株为恶性疟原虫氯喹抗性株,而在64pmol孔裂殖体形成受到完全抑制,则Fcc SM1/yN株对氯喹的抗性指数为32。（2）巢式PCR-RFLP分析以及对第二轮PCR扩增产物的测序结果显示Fcc SM1/yN株在76位点发生了K76T突变,并且该虫株携带编码氨基酸SVMNT（残基72～76）的pfcrt等位基因。（3）通过体外微量法确定氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、酮替芬和赛庚啶对Fcc SM1/yN株的IC50值分别为128.95nmol/L（95%可信区间为119.36～138.53nmol/L）、20.16nmol/L（95%可信区间为15.67～24.65nmol/L）、201.2nmol/L（95%可信区间为137.46～266.11nmol/L）、7.53μmol/L（95%可信区间为6.84～8.22μmol/L）、94.17μmol/L（95%可信区间为73.32～115.03μmol/L）和106.74μmol/L（95%可信区间为82.07～131.41μmol/L）。（4）0.0098μmol/L～0.078μmol/L的酮替芬或赛庚啶与0.3125nmol/L-2560nmol/L的氯喹配伍,氯喹对Fcc SM1/yN株的IC50值均在128nmol/L左右,表明对氯喹没有任何协同作用;0.15625μmol/L的酮替芬或赛庚啶与0.3125nmol/L～2560nmol/L的氯喹配伍,仅氯喹浓度10nmol/L孔和20nmol/L孔各孔200个疟原虫中3个核以上裂殖体的平均数目比单加氯喹的相应孔略有减少,氯喹对Fcc SM1/yN株的IC50值分别为108.2nmol/L（95%可信区间为97.48～118.93nmol/L）（氯喹/酮替芬组合）和113.74nmol/L（95%可信区间为102.83～124.64nmol/L）（氯喹/赛庚啶组合）,活性提高指数([无增效剂时的氯喹IC50值-增效剂存在时的氯喹IC50值]/无增效剂时的氯喹IC50值)分别为0.16（氯喹/酮替芬组合）和0.12（氯喹/赛庚啶组合）,表明对氯喹活性有微弱的增效作用;0.3125μmol/L的酮替芬或赛庚啶与0.3125nmol/L～2560nmol/L的氯喹配伍,仅氯喹浓度5nmol/L孔、10nmol/L孔和20nmol/L孔各孔200个疟原虫中3个核以上裂殖体的平均数目相对于单加氯喹的相应孔有所减少,氯喹对Fcc SM1/yN株的IC50值分别为88nmol/L（95%可信区间为75.76～100.24nmol/L）（氯喹/酮替芬组合）和97.39nmol/L（95%可信区间为86.02～108.77nmol/L）（氯喹/赛庚啶组合）,活性提高指数分别为0.32（氯喹/酮替芬组合）和0.25（氯喹/赛庚啶组合）,表明对氯喹活性的增效作用更强些;0.625μmol/L的酮替芬或赛庚啶与0.3125nmol/L～2560nmol/L的氯喹配伍,同样也是仅氯喹浓度5nmol/L孔、10nmol/L孔和20nmol/L孔各孔200个疟原虫中3个核以上裂殖体的平均数目相对于单加氯喹的相应孔有所减少,氯喹对FccSM1/yN株的IC50值分别为74.53nmol/L（95%可信区间为64.8～84.26nmol/L）（氯喹/酮替芬组合）和89.7nmol/L（95%可信区间为77.7～101.7nmol/L）（氯喹/赛庚啶组合）,活性提高指数分别为0.42（氯喹/酮替芬组合）和0.3（氯喹/赛庚啶组合）,表明对氯喹活性有更加明显的增效作用。另外,0.625μmol/L酮替芬或赛庚啶+5nmol/L氯喹各孔200个疟原虫中3个核以上裂殖体的平均数目相对于单加5nmol/L氯喹的相应孔减少程度比其他配伍剂量高（P＜0.05）,表明对于本研究这个配伍组合提高氯喹活性的效能最高;1.25μmol/L～5μmol/L的酮替芬或赛庚啶单独应用已有较明显的抑虫效果,与氯喹配伍时药物的单独效应仍占主要优势;氯喹作用0～7小时加酮替芬或赛庚啶,各时间段氯喹对Fcc SM1/yN株的IC50值没有明显差别,仅在第5小时稍有降低,到第6和第7小时达到高峰,分别为67.7nmol/L（95%可信区间为58.02～77.37nmol/L）（氯喹/酮替芬组合）和81.53nmol/L（95%可信区间为65.95～97.19nmol/L）（氯喹/赛庚啶组合）,活性增高指数分别为0.47（氯喹/酮替芬组合）和0.37（氯喹/赛庚啶组合）,8小时以后IC50值恢复为128nmol/L左右。（5）检测K76T和N86Y突变的巢式PCR-RFLP反应以及对第二轮扩增产物的测序结果显示,Fcc SM1/yN株疟原虫在6种药物和药物组合作用前后都存在pfcrt基因的K76T突变和pfmdr1基因的N86Y突变;而检测D1246Y突变的巢式PCR-RFLP反应结果则显示,Fcc SM1/yN株疟原虫在6种药物和药物组合作用前后以及作为对照的氯喹敏感株Fcc/HN株中都不存在D1246Y突变,对第二轮扩增产物的测序结果也显示Fcc SM1/yN株疟原虫在6种药物和药物组合作用前后都不存在D1246Y突变,表明Fcc SM1/yN株疟原虫pfmdr1基因的1246位点并没有发生突变,依然保持着野生株的基因型;对以上3个巢式PCR反应第二轮扩增产物的测序结果以及序列比对结果显示FccSM1/yN株疟原虫在6种药物和药物组合作用前后这3个片段的序列没有差异。（6）氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、氯喹/酮替芬组合以及氯喹/赛庚啶组合以一个IC50值的剂量或一个最佳配伍剂量作用于Fcc SM1/yN株疟原虫,至少在20小时左右的作用时间里,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因和pfmdr1基因在RNA表达水平上没有差别。但统计结果显示,氯喹、青蒿素和氯喹/酮替芬组合作用前后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因表达水平有差别（p＜0.05）,氯喹和氯喹/赛庚啶组合作用前后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfmdr1基因表达水平有差别（p＜0.05）。即氯喹、青蒿素和氯喹/酮替芬组合作用后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因表达水平提高,氯喹和氯喹/赛庚啶组合作用后Fcc SM1/yN株疟原虫pfmdr1基因表达水平降低。提示一个IC50值或一个最佳配伍剂量的氯喹、青蒿素和氯喹/酮替芬组合作用后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因表达水平有上调的趋势,一个IC50值或一个最佳配伍剂量的氯喹和氯喹/赛庚啶组合作用后FccSM1/yN株疟原虫pfmdr1基因表达水平有下调的趋势。RT-PCR结果显示,以内参条带亮度为标准,pfcrt和pfcrt基因各条带亮度一致,表明基因表达水平没有差别,与实时荧光定量PCR方法得到的结果一致。结论（1）Fcc SM1/yN株为恶性疟原虫氯喹抗性株。（2）适当的氯喹/酮替芬或者氯喹/赛庚啶配伍能够增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株Fcc SM1/yN株对氯喹的反应性,其中,同样浓度的酮替芬比赛庚啶对氯喹的增效作用强;氯喹作用0～6h内加酮替芬或赛庚啶对氯喹增效作用无明显差别,6～7h时加入增效效果明显,8h之后再加对氯喹已没有增效作用。（3）氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、氯喹/酮替芬组合以及氯喹/赛庚啶组合以一个IC50值的剂量或一个最佳配伍剂量作用于Fcc SM1/yN株疟原虫,至少在34h左右的作用时间里,都不使FccSM1/yN株疟原虫pfcrt和pfmdr1基因在DNA水平上发生任何改变。（4）上述抗疟药和药物组合以同样的剂量作用于Fcc SM1/yN株疟原虫,至少在20h左右的作用时间里,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt和pfmdr1基因在RNA表达水平上没有差别。统计学处理结果则提示,一个IC50值或一个最佳配伍剂量的氯喹、青蒿素和氯喹/酮替芬组合作用后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因表达水平有上调的趋势,一个IC50值或一个最佳配伍剂量的氯喹和氯喹/赛庚啶组合作用后FccSM1/yN株疟原虫pfmdr1基因表达水平有下调的趋势。
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标签：恶性疟原虫氯喹抗性株论文; 抗药性论文; 增效或逆转论文; 基因论文; 差异论文;