HBx编码蛋白质通过调节SPRY1编码蛋白质激活MAPK信号转导通研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（HBV）基因组中的X基因及其编码产物X蛋白（hepatitis B virus X protein, HBx）在HBV的复制中起着重要的调节作用。HBx参与多条细胞信号转导通路,对细胞的增殖,凋亡发挥重要的调节作用。它主要与细胞信号通路中一些关键性的调节蛋白质协同完成对细胞信号转导通路的调节作用。这些调控作用包括激活宿主细胞和病毒自身基因的转录、调控凋亡、抑制细胞中受损DNA的外切修复反应以及激活细胞中的信号转导通路如有丝分裂原（MAPK）、JAK、STAT的级联反应等。但是在HBx参与众多信号转导通路中,我们关注HBx激活MAPK信号转导通路,该通路是一条高度保守的模块,与细胞各种功能有关,包括细胞增殖,分化和迁移等,并且在肿瘤形成和迁移过程中发挥巨大的调节作用。但是目前并未发现HBx直接作用与MAPK信号中的蛋白酶受体,其激活的潜在分子机制尚未阐明。通过本课题的研究来初步阐明HBx编码的蛋白质在肝脏中是通过调节MAPK的抑制受体---SPRY1基因编码的蛋白质来激活MAPK信号通路。为了阐明该机制,本课题采取了一系列实验研究：（1）构建Flag-HBx、Myc-SPRY1 Myc-SPRY1-53-Mut真核表达载体；（2）确定Flag-HBx和Myc-SPRY1蛋白质之间是否存在相互作用；（3）探索Flag-HBx编码的蛋白质与Myc-SPRY1编码蛋白质相互作用结构域的研究；（4）Myc-SPRY1编码蛋白质是否影响Flag-HBx在哺乳动物HEK293细胞中的蛋白质表达水平；（5）AP-1荧光素酶报告基因实验研究Flag-HBx和Myc-SPRY1编码的蛋白质对AP-1转录因子的影响；（6）研究Flag-HBx和Myc-SPRY1编码的蛋白质对HEK293细胞凋亡、增殖的功能影响。所得结论如下：1.成功构建Flag-HBx、Myc-SPRY1、Myc-SPRY1-53-Mut,真核表达载体；2.通过免疫共沉淀（Co-IP）和Pull-down实验确定了Flag-HBx和Myc-SPRY1在哺乳动物HEK293细胞体内外存在相互作用；3.通过免疫共沉淀实验表明SPRY1第53位酪氨酸突变体并不影响它们之间的相互作用,但是AP-1荧光素酶报告基因实验表明SPRY1第53位酪氨酸突变体影响它与HBx之间对细胞信号转导通路的激活作用,因此我们推测它们相互作用区域是包括这一点的一段序列；4. Myc-SPRY1编码蛋白质影响Flag-HBx编码的蛋白质在哺乳动物HEK293细胞的表达水平,并且Flag-HBx编码的蛋白质水平随着Myc-SPRY1编码蛋白质表达水平的增加而增加；5. Flag-HBx协同Myc-SPRY1对核转录因子AP-1-luc的转录活性具有激活效应；6.通过细胞凋亡实验和细胞增殖实验发现,Flag-HBx促进HEK293细胞的增殖,抑制HEK293细胞的凋亡；并且发现当共转染Myc-SPRY1和Flag-HBx到HEK293细胞中时,Myc-SPRY1增加了Flag-HBx对HEK293细胞的抗凋亡作用,并且Myc-SPRY1上调了Flag-HBx对HEK293细胞的增殖水平的促进作用。

论文目录

• 英文缩写词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 主要仪器设备和常用试剂的配制
• 一、主要实验仪器设备
• 二、实验常用溶液的配制
• 第1章 绪论
• 1.1 HBX特性
• 1.2 HBX对细胞的凋亡作用
• 1.3 HBX对病毒周期具有调节作用
• 1.4 HBX参与多条细胞信号转导通路
• 第2章 构建FLAG-HBX和MYC-SPRY1真核表达载体
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 细胞株和质粒
• 2.1.3 Western Blot试剂
• 2.1.4 引物设计
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR模板
• 2.2.2 目的基因扩增体系
• 2.2.3 PCR产物的电泳分离
• 2.2.4 DNA的纯化回收
• 2.2.5 DNA酶切
• 2.2.6 连接反应
• 2法制备细菌感受态'>2.2.7 CaCL₂法制备细菌感受态
• 2.2.8 转化
• 2.2.9 阳性重组子的筛选
• 2.2.10 测序结果分析
• 2.2.11 脂质体转染细胞
• 2.2.12 收集、裂解细胞
• 2.2.13 Western Blot
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 第3章 HBX编码蛋白质与SPRY1编码的蛋白质之间相互作用验证
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 细胞株和质粒
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 免疫共沉淀（Co-IP）实验方法
• 3.2.2 GST-Pull Down实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 第4章 HBX编码蛋白质与SPRY1编码的蛋白质之间相互作用功能研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 细胞株和质粒
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 双荧光素酶报告基因实验
• 4.2.2 Western-Blot检测靶蛋白
• 4.2.3 细胞增殖活力检测
• 4.2.4 凋亡实验
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录A:攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 附录B:引物序列
• 附录C:PFLAG-CMV-2 VECTOR
• 附录D:PCMV-MYC VECTOR