论文摘要
转基因研究是近年来生命科学研究中热门、发展快的领域之一。相对于哺乳动物受精卵,鸟类的受精卵大且含大量卵黄,操作比较困难。人们寻找了另外一种细胞——PGCs细胞（primordial germ cells,PGCs,原始生殖细胞）代替受精卵作为转基因鸟类的载体。PGCs容易操作,在雌性中它最终发育为卵细胞,在雄性中最终发育为精子。PGCs在胚胎中的迁移途径——通过血液循环后移植入性腺,使它能成为冷冻保种的目标细胞,同时成为转基因鸟类制各中的良好载体。 本实验用40-60μm的玻璃针从孵化51-53小时的鸡胚卵黄静脉中取血,经Ficoll密度梯度离心纯化血液中的PGCs细胞,通过形态和过碘酸-希夫试剂染色鉴别,其纯度可达75%左右。同时分离孵化5天的鸡胚性腺细胞为基质细胞,在添加多种生长因子（胰岛素样生长因子IGF-1、碱性成纤维细胞生长因子b-FGF、白血病抑制因子LIF）的条件下培养PGCs细胞,探索其体外培养的最佳条件。 本研究以广东石歧杂鸡为提供PGCs细胞的供体鸡,以荷兰H系鸡为接受供体PGCs细胞的受体鸡。通过显微注射的方法,将冻存复苏后的PGCs供体细胞,浓缩至400个左右/μl,取1-1.5μl注入孵化60-64小时的受体鸡胚血液中。接受了供体PGCs细胞的受体鸡胚继续孵化。后提取受体鸡胚基因组DNA进行AFLP（amplified fragment length polymorphism,AFLP,扩增片段长度多态性）分子鉴定,测定实验后的鸡是否为嵌合体鸡及其嵌合率的指标。结果显示:制备的出壳前即死亡的36个受检鸡胚中,13个受检鸡胚为嵌合体,嵌合率达36%。存活至出壳的8个鸡胚,都为弱雏,AFLP分子鉴定3个为嵌合体,嵌合率为37.5%。 本研究建立了分离PGCs、体外培养PGCs、制备嵌合体的方法,不仅可以提供丰富的供体细胞来源,有利于PGCs体外的遗传操作,还为转基因鸡的成功制备创造条件。冷冻保存PGCs可以用于地方鸡种的保种,尤其是一些濒临灭绝的物种遗传资源的保存。
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标签：原始生殖细胞论文; 显微注射论文; 嵌合体论文; 扩增片段长度多态性论文;