哈维氏弧菌外膜蛋白基因ompU的克隆表达、DNA疫苗构建及对大菱鲆免疫效果探究

论文摘要

哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性菌,被认为是引起发光弧菌病的主要病原性弧菌。发光性弧菌病已经影响到大范围的海洋无脊椎动物,已有报道称很多国家养殖对虾的大量死亡是受到了哈维氏弧菌的感染引起的。哈维氏弧菌也与中国和南亚各国的鱼类细菌性疾病有关,其广泛的致病性和给水产养殖业造成的严重影响引起了世界范围的广泛关注。本研究的主要目的是从致病性哈维氏弧菌SF-1中克隆和表达一种外膜蛋白OmpU,探究其作为疫苗候选基因在大菱鲆对抗哈维氏弧菌感染时的免疫效果。在本实验中,一种外膜蛋白基因ompU从致病性哈维氏弧菌SF-1基因组中克隆,并在大肠杆菌原核表达系统中得到表达。ompU基因编码一个35kDa的蛋白,此蛋白可以通过Ni亲和柱亲和层析的方法得到纯化。将ompU基因插入到真核表达质粒载体pEGFP-N1中,制备成DNA疫苗。通过RT-PCR检测证实pEGFP-N1/ompU可以在大菱鲆肌肉组织内得到表达。纯化的外膜蛋白OmpU和重组质粒pEGFP-N1/ompU通过肌肉注射的方式分别对大菱鲆进行免疫,实验结果显示,OmpU蛋白疫苗在对抗致病性哈维氏弧菌SF-1中可以达到很好的保护效果,实验组大菱鲆在攻毒试验中的免疫保护率达到100%, DNA疫苗pEGFP-N1/ompU免疫组大菱鲆也起到了很好的保护效果,免疫保护率达到51.4%。通过间接ELISA可以检测到免疫组大菱鲆体内的特异性抗体反应。综上所述,我们从致病性哈维氏弧菌SF-1基因组中克隆和表达了一种外膜蛋白基因ompU,此蛋白被用于制作亚单位疫苗,重组质粒pEGFP-N1/ompU的DNA疫苗也被构建和在体内表达,对于免疫过的实验组大菱鲆来讲,无论是蛋白疫苗还是基因疫苗,在对哈维氏弧菌的感染中均可以起到较高水平的保护,引起显著的特异性抗体免疫。实验结果显示,ompU基因被认为是一种有效的疫苗候选基因,可用于研制亚单位疫苗和DNA疫苗预防由致病性哈维氏弧菌引起的鱼类养殖类疾病。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 鱼类细菌性疾病概况
• 2 哈维氏弧菌及其致病性
• 2.1 哈维氏弧菌流行病学
• 2.2 哈维氏弧菌致病机理研究
• 2.3 哈维氏弧菌外膜蛋白
• 3 鱼类的免疫系统简介
• 3.1 非特异性体液因子
• 3.2 特异性体液反应
• 4 疫苗的发展简介
• 5 DNA 疫苗
• 5.1 DNA 疫苗种类
• 5.2 DNA 疫苗可能的免疫机制
• 5.3 DNA 疫苗免疫的方法
• 6 本论文研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒
• 2.3 实验动物
• 2.4 培养基
• 2.5 试剂
• 2.6 仪器
• 2.7 哈维弧菌外膜蛋白基因ompU 的原核表达体系的构建
• 2.8 外膜蛋白基因ompU 真核重组表达体系的构建
• 2.9 由原核表达系统构建的亚单位疫苗和由真核表达体系构建的DNA 疫苗对大菱鲆免疫效果的研究
• 第三章 结果与分析
• 3.1 外膜蛋白 OmpU 在大肠杆菌中的表达
• 3.1.1 外膜蛋白OmpU 克隆及序列分析
• 3.1.2 原核表达质粒的构建及鉴定
• 3.1.3 外膜蛋白OmpU 在大肠杆菌中的表达
• 3.1.4 表达条件的优化
• 3.2 重组外膜蛋白OmpU 的纯化
• 3.3 pEGFP-N1/ompU 真核表达质粒在大菱鲆体内的表达
• 3.3.1 RT-PCR 检测ompU 基因在大菱鲆肌肉组织中的表达
• 3.3.2 Western-blot 检测外膜蛋白OmpU 基因在大菱鲆体内的表达
• 3.4 重组外膜蛋白OmpU 和真核表达质粒pEGFP-N1/ ompU 对大菱鲆的免疫效果研究
• 3.4.1 提取的蛋白和重组质粒的纯度检测
• 3.4.2 免疫大菱鲆血清效价水平的检测
• 3.4.3 真核表达质粒pEGFP-N1/ ompU 对大菱鲆的免疫保护效果
• 第四章 讨论和分析
• 4.1 哈维氏弧菌外膜蛋白 OmpU 原核表达载体的构建
• 4.1.1 相似性研究
• 4.1.2 原核表达载体的选择
• 4.1.3 外膜蛋白诱导条件的选择和优化
• 4.1.4 蛋白纯化
• 4.2 真核表达系统pEGFP-N1
• 4.2.1 检测真核重组表达质粒pEGFP-N1/ompU 在大菱鲆体内的表达
• 4.3 真核重组表达质粒pEGFP-N1
• 4.3.1 真核表达质粒pEGFP-N1/ompU 的浓度和纯度检测
• 4.3.2 免疫接种的途径和剂量
• 4.3.3 ELISA方法检测免疫大菱鲆血清中特异性抗体的效价
• 4.3.4 真核重组表达质粒pEGFP-N1/ompU 对大菱鲆的免疫保护效果
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢