论文摘要
目的:探讨ALDH1A1在人胃癌组织中的表达及临床意义。方法:免疫组织化学方法检测1072例胃癌组织及相应癌旁组织的ALDH1A1的表达。Western blot方法检测8例胃癌组织及癌旁组织的ALDH1A1的表达;Western blot方法检测6株胃癌细胞株细胞中的ALDH1A1的表达。结果:1、在1072例胃癌组织芯片中,535例（49.9%）胃癌组织,465例（43.3%）癌旁组织检测到ALDH1A1的表达,两者差异具有统计学意义（P<0.05）; ALDH1A1在癌组织中的表达与患者的年龄（>60岁）、胃壁浸润深度（T3/T4）、分化程度、淋巴结转移、TNM分期及PCNA表达相关;2、单因素及多因素生存分析提示ALDH1A1的表达与胃癌患者预后相关,是胃癌的独立预后因素之一;3、在低分化胃癌细胞株MKN-45中发现ALDH1A1的表达高于中分化胃癌细胞株MKN-28,两者ALDH1A1的表达均高于人永生化胃粘膜上皮细胞系GES-1;4例癌组织中的ALDH1A1的表达高于相应的癌旁组织。结论:1、ALDH1A1在胃癌组织中表达上调,与癌旁组织中的表达存在统计学差异;2、ALDH1A1表达与患者的年龄、胃壁浸润深度、分化程度、淋巴结转移、TNM分期及PCNA表达相关,提示ALDH1A1可能参与了胃癌的发生发展;3、ALDH1A1表达与胃癌患者预后相关,ALDH1A1有可能成为反映胃癌预后的一个新的肿瘤标志物。第二部分ALDH1A1基因过表达和RNAi表达载体构建与鉴定目的:为了进一步研究ALDH1A1在胃癌中的作用机制,我们采用基因工程和转染技术构建并鉴定ALDH1A1基因过表达和RNAi的表达载体。方法:1、通过基因克隆技术获得人ALDH1A1基因cDNA序列,将其克隆至T载体,测序正确后,经酶切、回收并连接到真核细胞表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-ALDH1A1表达载体,经酶切鉴定、测序正确后,用脂质体转染技术将pEGFP-N1-ALDH1A1表达载体转染人胃癌细胞株MKN-28细胞,根据绿色荧光蛋白的表达率确定转染效率,利用免疫印迹法鉴定表达产物,紫外-可见分光光度法测定ALDH活性的改变;2、构建能表达针对人类ALDH1A1基因cDNA序列siRNA的PGPU6/GFP/NEO-ALDH1A1表达载体,应用脂质体转染技术将PGPU6/GFP/NEO-ALDH1A1表达载体转染人胃癌细胞株MKN-45细胞,根据绿色荧光蛋白的表达率确定转染效率,利用免疫印迹法鉴定表达产物,紫外-可见分光光度法测定ALDH的活性。结果:1、成功克隆到人ALDH1A1基因的全长cDNA,经测序与GeneBank序列完全一致;2、成功构建了pEGFP-N1-ALDH1A1表达载体,经Western blot鉴定显示ALDH1A1在MKN-28细胞中过表达,ALDH活性测定证实转染组的ALDH活性较对照组明显升高;3、成功将PGPU6/GFP/NEO-ALDH1A1转染到MKN-45胃癌细胞中,经Western blot鉴定显示ALDH1A1在MKN-45细胞中表达明显下降,ALDH活性测定证实转染组的ALDH活性降低。结论:成功构建并鉴定了ALDH1A1基因过表达和RNAi真核表达载体。第三部分ALDH1A1基因过表达和RNAi后对胃癌细胞生物学功能的影响目的:研究ALDH1A1基因对胃癌细胞生物学功能的影响。方法:利用本研究第二部分建立的ALDH1A1过表达的MKN-28细胞模型和ALDH1A1 RNAi的MKN-45细胞模型,采用细胞计数法、MTT法、克隆形成实验、Transwell小室移行和侵袭实验,检测ALDH1A1表达改变后,对胃癌细胞增殖能力、克隆形成能力、移行和侵袭能力的影响。结果:细胞计数法、MTT法检测证实ALDH1A1过表达促进MKN-28细胞增殖能力,RNAi干扰ALDH1A1表达后抑制MKN-45细胞的增殖;克隆形成实验显示ALDH1A1过表达促进MKN-28细胞克隆形成,RNAi干扰ALDH1A1表达后抑制MKN-45细胞克隆形成;Transwell小室移行和侵袭实验证实ALDH1A1过表达能够促进MKN-28细胞的移行和侵袭能力,RNAi干扰ALDH1A1表达后能够抑制MKN-45细胞的移行和侵袭能力。结论:ALDH1A1具有促进胃癌细胞增殖、克隆形成、移行和侵袭的作用,有可能成为胃癌治疗的新型候选靶点。