抑制纤维连接蛋白的合成诱导大鼠系膜细胞凋亡的机制研究

论文题目: 抑制纤维连接蛋白的合成诱导大鼠系膜细胞凋亡的机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 肾脏病学

作者: 吴镝

导师: 陈香美

关键词: 纤维连接蛋白,凋亡,大鼠

文献来源: 中国人民解放军军医进修学院

发表年度: 2005

论文摘要: 目的:肾小球硬化和/或间质纤维化是肾脏疾病走向终末期肾功能衰竭的最终途径。肾脏纤维化过程中普遍存在着细胞外基质（ECM）的过度积聚和细胞增殖。纤维连接蛋白（fibronectin,FN）是ECM重要成分之一,在细胞粘附、移动、增殖等方面起着极其重要的作用。在大多数肾小球硬化及间质纤维化中都可观察到FN的过度积聚。本研究目的在于,利用RNAi（RNAinterference）技术,直接抑制内源性FN的合成。观察FN的缺失对大鼠肾脏系膜细胞增殖与凋亡的影响。进而阐明凋亡的途径以及细胞内钙离子的异常在凋亡中的作用。方法:分离并培养大鼠原代肾小球系膜细胞。体外合成siRNA（small interference RNA）,选取抑制效果最佳的片段。构建表达ShRNA（small hairpin RNA）的逆转录病毒载体,稳定抑制大鼠系膜细胞FN的表达。应用实时定量PCR、Western blot、细胞免疫荧光检测FN的表达水平。应用JC-1染色检测线粒体功能。流式细胞仪技术检测凋亡细胞数量。在细胞培养过程中加入环孢霉素A、外源性FN以及caspase3、8的阻断剂,判定细胞凋亡的途径。利用共聚集显微镜检测应激条件下内质网InsP3（1,4,5-tdphosphate receptor）受体及RyR（Ryanodine receptor）钙通道的开放情况。在诱导凋亡过程中加入L型钙通道阻断剂及内质网钙InsP3受体及RyR钙通道阻断剂,确定钙离子在FN缺失导致凋亡中的作用。结果:合成的siRNA及逆转录病毒载体所表达的shRNA都可以有效地抑制系膜细胞FN的合成,而且长时间的抑制会导致系膜细胞出现凋亡。FN缺失后出现的细胞凋亡过程中,发现内源性凋亡途径的主要成分细胞色素c释放、caspase 9和caspase 3的激活;而外源性凋亡途径的最主要成分caspase8的表达没有明显变化,并且caspase 8被特异阻断后,不影响FN缺失诱发的细胞凋亡。该结果提示内源性凋亡途径的启动是FN缺失后细胞凋亡的原因,而外源性凋亡途径在此凋亡中不起主要作用。进一步对凋亡启动机制的

论文目录:

中文摘要

英文摘要

正文

实验研究一利用RNAi方法抑制大鼠系膜细胞分泌纤维连接蛋白

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

实验研究二内源性凋亡途径的启动诱导系膜细胞纤维连接蛋白缺失后的凋亡

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

实验研究三细胞膜及内质网钙通道阻断剂对纤维连接蛋白缺失所诱导凋亡的保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

文献综述(一) RNAi的实现方法及其今后在临床中的应用

文献综述(二) 钙离子与细胞凋亡关系的研究进展

附录英文缩略词表

攻读学位期间发表论文情况

致谢

发布时间: 2005-07-15

参考文献

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抑制纤维连接蛋白的合成诱导大鼠系膜细胞凋亡的机制研究

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