论文摘要
目的蛋白质间的相互作用形成的复杂网络——细胞信号转导，是研究细胞利用“生物信号转导网络”对外界刺激做出反应的分子机制。这个复杂的细胞信号网络如同细胞的神经系统，控制着正常生物细胞的生长、分化和凋亡。细胞信号转导的失控可导致许多人类疾病，已经成为生物学研究的一个重要领域，并对未来药物的开发具有重要意义。因此，蛋白质间的相互作用作为信号转导研究的主要内容而被广泛关注，许多研究蛋白质间相互作用的方法应运而生，其中酵母双杂交技术是目前应用最广泛的用于研究已知和未知蛋白质相互作用、蛋白质功能域、蛋白质与小分子间相互作用以及药物靶点筛选和设计的方法。本实验室利用外显子捕获和外显子拼接技术在富含疾病基因的人染色体8p22区域克隆的新基因——SH2A，应用蛋白质结构分析软件（SMART）分析显示其编码产物具有一个SH2结构域，因此推测其是SH2信号蛋白家族成员之一。SH2结构域是一种广泛存在于蛋白质的结合基序，结构高度保守，特异识别磷酸化酪氨酸残基，是细胞内信号转导的重要组件，主要参与酪氨酸蛋白激酶相关受体介导的信号转导过程，是上游与下游信号分子联系的分子基础，参与细胞的生长、增殖和分化等过程的调节，并与某些疾病的发生关系密切。因此研究含有SH2结构域的蛋白质在生理和病理条件下的作用机制，将为临床药物开发提供重要依据。前期工作中，已经将SH2A亚细胞定位在细胞质中，并且研究发现野生型SH2A能够强烈抑制细胞蛋白激酶C（PKC）活性，而缺失型载体对细胞的PKC活性几乎没有影响，提示SH2A可能阻止了PKC信号通路向下传递。迄今为止，SH2A的确切生物学功能尚不清楚。为了深入研究SH2A的生物学功能，明确其在信号传导通路中与其他蛋白质的相互作用，本实验利用酵母双杂交系统，用体外构建的pGBKT7-SH2A诱饵蛋白重组表达载体筛选人类肾脏cDNA文库，初步筛选出与SH2A相互作用的五种蛋白质，从而为进一步研究SH2A在信号转导中的生物学功能提供了信息。实验方法1、构建pGBKT7-SH2A诱饵蛋白重组表达载体。2、扩增人肾脏cDNA文库。3、共转化酵母并进行酵母双杂交筛选。4、筛选出阳性克隆，DNA测序，序列比对。5、预测筛查出的蛋白质的磷酸化酪氨酸位点。实验结果1、将SH2A克隆入含有BD的pGBKT7载体中，构建了pGBKT7-SH2A诱饵蛋白重组表达载体。2、扩增了约3.25L人肾脏cDNA文库。3、提取扩增后的人肾脏cDNA文库和pGBKT7-SH2A质粒，共转化酵母感受态，经过三步筛选，在SD／-Ade／-His／-Leu／-Trp培养后，挑选了61个克隆，再经SD／-Ade／-His／-Leu／-Trp／X-α-Gal检测，共得到46个蓝色的阳性菌落。4、对阳性克隆进行测序，所得测序结果进行比对分析，推测其所编码的蛋白质，共筛选得到五种SH2A相互作用蛋白质：AZGP1、DAD1、HSD17810、HTATIP和PKM2；以及两种非编码序列：CARD14和RAS-like，estrogen-regulated，growth inhibitor。5、蛋白质预测工具预测筛选得到的五种蛋白质的酪氨酸磷酸化位点，除了PKM2未预测到酪氨酸磷酸化位点外，其他四种蛋白质——AZGP1、DAD1、HSD17810和HTATIP均存在酪氨酸磷酸化位点。结论1、成功应用酵母双杂交技术进行蛋白质相互作用研究。2、筛查到五种可能与SH2A相互作用的蛋白质。