工程菌制备表柔红霉素工艺的研究

论文摘要

表柔红霉素是重要的抗肿瘤药物，同时也是工业生产表阿霉素的重要前体。以表柔红霉素基因工程菌SIPI-A0707发酵方法生产表柔红霉素可以省去多步的化学合成反应，降低成本，减少污染，创造很大的经济效益和社会效益。本文对表柔红霉素的发酵工艺和分离纯化工艺进行了系统的探索。本实验室首先将表柔红霉素产生菌基因工程菌SIPI-A0707进行自然分离，得到一株传代稳定的高产菌株N25，并将其作为出发菌株进行选育。首先考察了紫外诱变的最佳剂量，并在此剂量下进行两次连续诱变，对每次诱变获得的高产菌株进行传代稳定性考察，最终得到一株产量比出发菌株提高21%，传代稳定的突变株UV21。然后将紫外诱变得到的高产菌株UV21进行产物耐受性筛选，首先考察了柔红霉素添加到高氏培养基的最佳剂量，并在此剂量下进行筛选，对每次诱变获得的高产菌株进行传代稳定性考察，最终得到一株产量比出发菌株提高了44%，传代稳定的突变株SIPI-A0708。将突变株SIPI-A0708进行摇瓶培养，考察发酵培养基的碳源、氮源和无机盐对发酵及产抗水平的影响，得到一组较适宜的发酵培养基配方；并在此培养基配方下，对其培养条件进行考察，初步确立了较合适的培养条件。培养基及培养条件优化后，突变株的发酵水平比未优化前提高了96%。以摇瓶培养基优化后的配方和条件为基础，放大至15L发酵罐进行发酵，单位提高了129%。优化了从发酵液中分离纯化表柔红霉素的工艺路线：首先对发酵液中的目的产物进行粗提；然后通过吸附洗脱实验优选出合适的大孔阳离子交换树脂，并对该树脂的层析参数进行考察，富集目的产物和除去部分杂质，再通过吸附洗脱实验优选出合适的大孔吸附树脂，并对该树脂的层析参数进行考察，建立合适的吸附洗脱条件，最后冷冻干燥制得成品，该成品的HPLC纯度为98.1%，整个分离工艺总收率在40%以上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 蒽环类抗生素简介
• 1.2 蒽环类抗生素的作用机理
• 1.3 四种重要的蒽环类抗生素
• 1.4 柔红霉素的生物合成途径
• 1.5 立题依据
• 第2章 产表柔红霉素菌株的选育
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种的保藏
• 2.1.2 发酵菌株的自然分离
• 2.1.3 发酵菌株的筛选
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 发酵菌株的自然分离
• 2.2.2 紫外诱变结果分析
• 2.2.3 产物耐受性结果分析
• 2.3 高产菌株 SIPI-A0708 的菌落形态考察
• 2.4 本章小结
• 第3章 表柔红霉素的发酵工艺研究
• 3.1 仪器和材料
• 3.1.1 菌种及标准品
• 3.1.2 材料和试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 分析方法
• 3.2.2 初始培养基和培养条件
• 3.2.3 斜面培养基优化
• 3.2.4 发酵培养基的优化
• 3.2.5 摇瓶发酵培养条件的优化
• 3.3 15L 发酵罐工艺的研究
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 斜面培养基的优化
• 3.4.2 发酵培养基的优化
• 3.4.3 摇瓶发酵培养条件的优化
• 3.5 发酵罐工艺的研究
• 3.6 本章小结
• 第4章 表柔红霉素分离纯化工艺的优化
• 4.1 仪器和材料
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 材料
• 4.1.3 理化性质
• 4.2 初始表柔红霉素分离纯化工艺
• 4.3 分离纯化方法的优化
• 4.3.1 表柔红霉素的粗提
• 4.3.2 表柔红霉素的纯化
• 4.3.3 表柔红霉素的精制
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 表柔红霉素的粗提
• 4.4.2 表柔红霉素的纯化
• 4.4.3 表柔红霉素的精制
• 4.4.4 浓缩
• 4.5 表柔红霉素的分离纯化放大工艺研究
• 4.6 本章小结
• 第5章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历