柿果实类胡萝卜素形成的分子生理机制研究

论文摘要

柿（Diospyros kaki L.）属于柿科柿属,为我国特产珍果,具有多种保健功能。类胡萝卜素是柿果实中主要的色素,其含量和组成决定了果实的外观色泽和商品性。本文以柿果实为材料,鉴定了柿果实主要的类胡萝卜素组分,分析了46个柿品种果实果肉类胡萝卜素含量,克隆了5个类胡萝卜素合成相关基因,并研究了相关基因在柿果实中的表达,分析了不同类型柿果实类胡萝卜素积累差异及其与相关基因表达的关系,主要研究结果如下:1、鉴定了9种类胡萝卜素成分,分别是新黄质、堇菜黄质、9-顺-堇菜黄质、叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和番茄红素。β-隐黄质是柿果皮和果肉中最主要的类胡萝卜素成分,占所有品种总有色类胡萝卜素的20-30%。不同柿品种果肉中类胡萝卜素含量在194.61±15.94μg/100g FW到1566.30±116.33μg/100g FW之间,其中β-隐黄质和玉米黄质占37.84-85.11%。不同品种RE值也存在着较大的差异,其范围在8.62μg/100g FW到90.57μg/100g FW之间。除了品种之外,栽培的区域和成熟的阶段对于柿果实中类胡萝卜素含量和RE值也具有十分重要的影响。2、从柿果实中克隆了5个类胡萝卜素合成相关基因,分别是DkPSY、DkZDS、DkPDS、DkLCYB和DkBCH。其中,DkPSY和DkBCH获得DNA全长序列,DkPDS与DkLCYB得到cDNA全长序列,而DkZDS只分离到3′端的部分序列。DkPSY基因包含6个外显子与5个内含子,DkBCH基因包含7个外显子和6个内含子。经过NCBI Blast的比对,发现这5个基因的核苷酸和所编码的氨基酸序列与其它植物都具有很高的同源性。3、以‘小方柿’为材料来研究已克隆的基因在果实不同部位中的表达水平,5个基因在果皮组织中的表达水平最高;在用于分析的5个基因中,DkBCH基因的表达水平明显高于其他基因。以‘富有’为材料来研究已克隆的基因在果肉组织发育期间的表达模式,DkPDS和DkZDS mRNA水平基本上持续增长,DkPSY和DkBCH mRNA水平在第4和第3阶段分别下降,然后再继续增长直至最大值,但DkLCYB mRNA水平一直处于较低的水平。4、随着果实的发育,‘牛心柿’和‘西村早生’的果实品质指标变化趋势均较一致,只是数量上存在差异。在果实的整个发育过程中,类胡萝卜素总量持续增加,且‘西村早生’一直高于‘牛心柿’。在果实成熟时,上游DkPSY、DkPDS、DkZDS基因的表达水平较高,加上它们之间的协同作用,合成大量的番茄红素,但一方面番茄红素向叶黄质转变,可能是由于DkLCYE和DkLCYB表达水平较低,使得α-胡萝卜素和叶黄质含量很低,甚至在检测极限以下;另一方面番茄红素向β-胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质等转变,DkBCH基因大量表达引起了下游相关产物的积累量加大,特别是β-隐黄质、玉米黄质和9-顺-堇菜黄质,最终番茄红素的量却很少。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 类胡萝卜素的结构
• 1.1 胡萝卜素类
• 1.2 叶黄素类
• 2 类胡萝卜素分析的研究进展
• 2.1 类胡萝卜素的提取方法
• 2.2 类胡萝卜素的分离方法
• 2.3 类胡萝卜素的分析测定方法
• 3 类胡萝卜素的功能
• 4 类胡萝卜素的生物合成途径及关键基因
• 4.1 生物合成途径
• 4.2 生物合成相关酶及关键基因
• 5 影响类胡萝卜素含量的因素
• 5.1 种类
• 5.2 品种
• 5.3 产地
• 5.4 部位
• 5.5 发育阶段
• 5.6 外部因子
• 5.7 基因工程
• 6 研究的目的和意义
• 第二章 柿果实类胡萝卜素含量的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 果实主要品质测定
• 1.2.2 果实颜色测定
• 1.2.3 类胡萝卜素样品的制备
• 1.2.4 类胡萝卜素成分定性和定量分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 柿果实品质指标和果皮颜色评价
• 2.2 柿果实类胡萝卜素成分的鉴定
• 2.3 柿果肉类胡萝卜素含量的测定
• 2.4 不同栽培地点柿果肉类胡萝卜素含量的测定
• 2.5 不同成熟阶段柿果肉类胡萝卜素含量的测定
• 3 结论
• 第三章 柿果实类胡萝卜素合成相关基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 总RNA 的提取
• 1.2.2 总RNA 的纯化
• 1.2.3 cDNA 全长的克隆
• 1.2.4 DNA 的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 PSY 基因的克隆与分析
• 2.1.1 cDNA 全长序列的克隆
• 2.1.2 DNA 序列的克隆
• 2.1.3 DkPSY 基因的生物信息学分析
• 2.2 PDS 基因的克隆与分析
• 2.2.1 cDNA 全长序列的克隆
• 2.2.2 DkPDS 的生物信息学分析
• 2.3 ZDS 基因的克隆与分析
• 2.3.1 3′端cDNA 片段的克隆
• 2.3.2 3′端cDNA 片段的序列分析
• 2.4 LCYB 基因的克隆与分析
• 2.4.1 cDNA 全长序列的克隆
• 2.4.2 DNA 序列的克隆
• 2.4.3 DkLCYB 的生物信息学分析
• 2.5 BCH 基因的克隆与分析
• 2.5.1 cDNA 全长序列的克隆
• 2.5.2 DNA 序列的克隆
• 2.5.3 DkBCH 的生物信息学分析
• 3 讨论
• 第四章 柿果实类胡萝卜素合成相关基因的时空表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 总RNA 的提取
• 1.2.2 总RNA 的纯化
• 1.2.3 第一链cDNA 的合成
• 1.2.4 引物设计
• 1.2.5 RT-PCR 反应
• 1.2.6 Real-Time PCR 反应
• 2 结果与分析
• 2.1 柿果实类胡萝卜素合成相关基因在果实不同部位的表达
• 2.2 柿果实类胡萝卜素合成相关基因在果实不同发育时期的表达
• 3 讨论
• 第五章 不同类型柿果实类胡萝卜素积累的差异及其与相关基因表达的关系
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 果实主要品质测定
• 1.2.2 果实颜色测定
• 1.2.3 类胡萝卜素样品的制备
• 1.2.4 类胡萝卜素成分定量分析
• 1.2.5 总RNA 的提取
• 1.2.6 总RNA 的纯化
• 1.2.7 第一链cDNA 的合成
• 1.2.8 引物设计
• 1.2.9 Real-Time PCR 反应
• 2 结果与分析
• 2.1 品质及颜色指标的变化
• 2.2 类胡萝卜素含量分析
• 2.3 类胡萝卜素合成相关基因的表达
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 已登录基因