淡色库蚊核糖体蛋白S4基因克隆及其在溴氰菊酯抗性作用中的初步研究

论文摘要

【目的】克隆淡色库蚊核糖体蛋白S4（RPS4）基因的全长序列，并研究其与蚊抗药性的相关性。【方法】根据本试验室抑制性差减杂交结合cDNA芯片筛选获得的EST片段（GenBank accession no．BE247804）设计引物，分别与载体序列配对，通过PCR的方法，从淡色库蚊抗性品系中分别扩增出目的基因的5′和3′末端，分别T／A克隆于pGT载体，转化、测序、对位拼接获取全长序列。用Clustal X、Clustal W等生物信息学软件对编码的氨基酸序列进行分析。用实时荧光定量PCR验证RPS4基因在淡色库蚊抗性、敏感品系不同发育阶段中的差异表达。应用基因重组方法构建RPS4基因的原核和昆虫表达载体；将重组的昆虫表达载体转入蚊C6／36细胞，经药物筛选获得稳定转染的细胞系，RT-PCR鉴定目的基因表达；用3H-TdR掺入法检测稳定表达的单克隆细胞对溴氰菊酯的敏感性。【结果】获得淡色库蚊RPS4基因的全长cDNA序列，总长度为1002 bp，开放阅读框为789 bp，编码262个氨基酸（GenBank accessionno．DQ647667）。淡色库蚊RPS4与埃及伊蚊、冈比亚按蚊、果蝇的RPS4同源性分别为96％、91％、78％。荧光定量PCR结果显示，RPS4基因在淡色库蚊抗性和敏感品系的不同发育阶段均有表达；在蛹和成虫发育阶段，与敏感品系相比，RPS4基因在抗性品系中高表达（P＜0.01）。成功构建了RPS4基因的原核和昆虫表达载体。3H-TdR掺入法结果显示，在一定浓度的溴氰菊酯处理下，转染RPS4基因的细胞存活率与对照组相比，无显著性差异（P＞0.05）。【结论】本研究获得了淡色库蚊RPS4基因的全长cDNA序列。该基因在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中（蛹和成虫期）高表达，提示该基因与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关，但其在细胞对抗溴氰菊酯的毒性作用中未发现有保护作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 实验材料
• 1 实验蚊
• 2 主要试剂
• 3 菌株和质粒
• 4 细胞株
• 5 主要仪器
• 实验方法
• 1 淡色库蚊 RPS4基因全长克隆
• 2 RPS4基因生物信息学分析
• 3 定量 PCR分析 RPS4基因在抗性、敏感品系不同发育阶段的表达
• 4 原核表达载体的构建
• 5 昆虫表达载体的构建
• 6 RPS4基因与溴氰菊酯抗性的初步研究
• 结果
• 1 淡色库蚊 RPS4基因全长克隆
• 2 RPS4基因生物信息学分析
• 3 定量 PCR分析 RPS4基因在抗性、敏感品系不同发育阶段的表达
• 4 原核表达载体构建
• 5 昆虫表达载体构建
• 6 RPS4基因与溴氰菊酯抗性的初步研究
• 讨论
• 1 核糖体蛋白S4全长基因克隆分析
• 2 核糖体蛋白S4与抗药性
• 小结
• 参考文献
• 淡色库蚊核糖体蛋白RPS4基因GenBank收录证明
• 在读期间发表的论文目录
• 在读期间发表的SCI论文
• 致谢
• 综述: 视蛋白研究及其主要进展