论文摘要
美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus,HcNPV）生物杀虫剂能有效控制寄主美国白蛾种群的数量,在生物防治中起到了重要的控害作用,具有重要的经济、生态、环保价值,应用前景十分广阔。本文应用生物测定、组织病理切片、电镜技术、分子生物学、免疫组化等方法,初步研究HcNPV与Bt混合致病机理及其病毒对寄主种群中的持续控制作用,力争从多个角度揭示HcNPV与寄主的互作机理。主要研究内容和结果如下:混合感染试验表明,当两病原浓度接近LC50时,美国白蛾幼虫可表现出病毒或细菌的症状,并依次出现细菌和病毒两个发病高峰期。用各病原浓度接近LC50混合感染,与各单剂单独作用相比,可提前发病高峰期12-24h,表明病原混合作用可加强各病的致病力;当Bt浓度为10、25mg/L时对HcNPV的毒力有增效作用;而Bt浓度为5mg/L时,对HcNPV的毒力表现出减效作用;而HcNPV浓度为1.6×105、1.6×106、1.6×107 PIBs/mL时,对Bt的毒力均有增效作用。混合感染增效可使半数致死时间（LT50）缩短0.5-2.1d。说明病原混合感染寄主对其病原的致病性有明显影响,浓度配比是混合侵染提高效力的关键因素。4龄初幼虫接种后按不同时间取样,制成石蜡切片,进行H.E染色。观察了HcNPV、Bt和HcNPV+Bt混合侵染寄主所引起的中肠上皮细胞、脂肪体细胞、表皮细胞、精巢的病变过程。观察发现,病毒和细菌混合感染,6-48h中肠上皮细胞顶端肿胀呈囊泡状,细胞质积聚在顶部;72h-144h表现病毒病症,与病毒单独感染相比,出现病毒症状的时间略早,病变的程度也较严重,组织细胞降解的速度也明显加快,说明混合感染加重了病理变化,加速了幼虫死亡。对寄主的超微结构观察表明,Bt感染24h,中肠上皮细胞、杯状细胞出现病理变化,48h细胞质出现空泡,72h病变加重,上皮细胞大多从基底膜脱落。混合感染幼虫,感染24h,中肠上皮细胞出现病理变化,96h出现病毒粒子复制,而脂肪体24h无明显病理变化,48h出现病理变化,120h出现病毒粒子复制,至144h-168h中肠、脂肪体细胞核内病毒粒子大量复制,出现包埋病毒粒子多角体,尤其中肠细胞核内充满了多角体,细胞核胀大,几乎占满了整个细胞。HcNPV感染精巢组织细胞核在144h出现病毒发生基质,168h有病毒核衣壳形成。上述结果表明,病毒侵染中肠细胞比脂肪体细胞早24h,中肠在中后期出现带囊膜病毒粒子的复制,在晚期有大量的多角体在细胞核内形成,而在多数鳞翅目昆虫中,这种情况比较少见。同时在精巢细胞发现病毒发生基质,这些变化在美国白蛾寄主中还未见报道。免疫组化观察HcNPV在寄主组织中的定位情况,结果表明其经口感染寄主的病理时相:感染后48h,在中肠检测到个别阳性信号;72-96小时,在气管、脂肪体、表皮同时检测到病毒抗原,中肠的阳性信号也在增多;感染后120小时,气管上皮细胞、脂肪体和真皮细胞的细胞核肿大,阳性信号增强;感染后144小时,在脂肪体、气管、真皮的上皮组织中全部检测到阳性信号。上述结果说明,中肠细胞阳性信号出现的早,但数量增加缓慢,其它组织阳性信号出现的晚,但病毒增殖速度快;HcNPV+Bt混合感染阳性信号出现的时间早于病毒单独感染,说明混合感染增强了病毒在寄主体内的复制。肌肉组织中始终未见阳性信号,表明肌肉未被侵染。需要指出的是,在感染144h后,精巢的精囊细胞内检测到病毒抗原的阳性信号,表明病毒侵染了精巢组织。对染病寄主的血淋巴蛋白浓度和SDS-PAGE分析表明,HcNPV使寄主的血淋巴蛋白在染病后连续6d中,除在第72h、96h突然升高,明显高于对照外,其余时间血淋巴蛋白含量浓度均低于对照;三种蛋白（普通蛋白、糖蛋白、脂蛋白）电泳图谱与对照相比变化不明显,普通蛋白在第72h、96h的血淋巴蛋白,在中分子量区域出现相对含量上的变化及迁移位置的变动。糖蛋白、脂蛋白图谱变化相似。上述结果说明,HcNPV对寄主的血淋巴代谢有抑制作用,可能是病毒感染破坏了脂肪体组织,损坏了合成代谢蛋白质的功能,导致了血淋巴蛋白浓度的变化。用HcNPV感染美国白蛾幼虫后,对其亲代、子一代、子二代的幼虫致死率、蛹重、产卵量、卵孵化率及染病成虫繁殖对子代影响进行了生物测定和观察研究,结果表明,与对照比较,各项检测指标经生物统计,均表现出差异显著。说明HcNPV在寄主种群中能够传代,对种群的数量起到了一定控制作用。应用PCR检测染病寄主当代、次代卵总DNA,发现HcNPV的扩增产物,证明HcNPV在分子水平上可以垂直传播给子代。HcNPV在寄主中连续传代7次后,对第0、3、5、7代进行了生物活性测定、电镜观察、病毒粒子蛋白SDS-PAGE电泳、基因组DNA限制性内切酶酶解分析等研究,生物活性测定结果说明,各代病毒毒力没有明显差异。第7代病毒与原始感染病毒电镜观察,在多角体和病毒粒子形态方面未发现明显变化。各代病毒的结构多肽基本一致,有25-26条多肽,只是第3、7代病毒出现了一条新增条带,分子量约为42.0 kD。病毒核酸经BGⅡ,EcoRI,PST,PVUⅡ4种酶解,各代NDA的酶切位点、片段大小基本完全一致。说明,HcNPV经传代7次后,病毒核酸遗传稳定,病毒粒子多肽的变化只是病毒与寄主互作的适应性改变,并未改变其遗传特性。对HcNPV的5种分离株进行了比较研究,结果发现,其多角体、病毒粒子在形态方面没有明显差异;生物活性比较,其中一株LC50、LT50明显优于其它毒株;结构多肽电泳、病毒DNA酶切图谱存在一定差异。
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