首页> 正文

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体制备及其检测方法的建立

2020-12-01阅读(562)

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体制备及其检测方法的建立

论文摘要

小麦赤霉病菌产生的毒素不仅在病害发展过程中具有加重赤霉病的作用,而且污染谷物导致严重的食用安全性问题。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）是其产生的最重要的一种毒素,由于DON的危害严重,引起了各国的普遍重视,建立快速、灵敏、有效的毒素检测方法显得十分迫切。真菌毒素的检测传统上一直是以色谱化学技术为依托,但免疫检测方法具有检测快速、费用低廉、易于操作、简单易携、且高灵敏度等特点,近年来日益受到国内外广泛的关注。本试验旨在制备可用于检测被脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的粮谷类特异性单克隆抗体。本试验首先将脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的衍生物3-半琥珀酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-HS-DON）与卵清蛋白（OVA）采用碳化二亚胺法进行偶联得到人工抗原,以此人工抗原免疫BAL B/C小鼠,取该鼠脾细胞与SP 2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和克隆,得到了1株能稳定分泌DON抗体的单克隆细胞株（3B2）,并制备单克隆抗体腹水。经检测3B2的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链.腹水通过间接酶联免疫吸附测定效价在1×107以上。该单克隆抗体与脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异性结合反应的50%抑制质量浓度为29μg/L,除与3-acetyldeoxynivalenol（3-Ac-DON）的交叉反应率为78.38%,与其他脱氧雪腐镰刀菌烯醇结构类似物无交叉反应,具有较高的灵敏度和特异性,有较好的应用价值。本研究成功制备的高亲合力和高特异性的抗DON单克隆抗体,为建立谷物和农产品中DON的快速免疫检测技术奠定了基础。选取杂交瘤细胞株3B2所分泌的抗体进行研究,建立了ELISA检测体系,其检测条件为:样品提取液甲醇的浓度为8%,包被抗原3-HS-DON-BSA浓度2μg/mL,腹水稀释至1×10-7,2%卵清蛋白（OVA）作为封闭物;OD450吸光值作纵坐标与DON浓度（μg/mL）的对数值作横坐标建立检测曲线,在0.01μg/mL-10μg/mL范围内呈显著线性关系,检测方程为y=0.2396x+0.3177,相关系数达0.9999,检测极限值为11μg/L。批内和批间变异系数分别为1.2%和4.7%,标样的添加回收率分别为90.73%、89.30%、86.80%和80.12%。

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 引言
  • 上篇 文献综述
  • 第一章 食品安全概述
  • 1.食品安全的重要意义
  • 1.1.食品安全是人体健康的需要
  • 1.2.食品安全是发展社会生产力的动力
  • 1.3.食品安全是国际贸易的保证
  • 2.食品安全的主要污染物
  • 3.食品安全检测技术种类及应用
  • 第二章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇概述
  • 1.DON的主要分布与危害
  • 2.DON的理化性质
  • 3.DON的毒性与作用机理
  • 3.1.DON的急慢性毒性作用
  • 3.2.DON的细胞毒性作用
  • 3.3.DON的遗传毒性
  • 3.4.DON的免疫毒性作用
  • 4.DON的分离
  • 4.1.DON的提取
  • 4.2.DON的净化
  • 第三章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的研究
  • 1.薄层色谱法（thin-layer chromatography,TLC）
  • 2.气相色谱（gas chromatography,GC）
  • 3.高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）
  • 4.红外光谱分析
  • 5.免疫学分析方法
  • 5.1.免疫学基本原理
  • 5.2.小分子免疫检测的基本原理
  • 5.3.DON免疫原及其特异性单克隆抗体的制备
  • 5.4.免疫学检测技术
  • 下篇 研究内容
  • 第一章 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备及鉴定
  • 1.材料与方法
  • 1.1.试剂及主要仪器
  • 1.2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇完全抗原的制备
  • 1.3.动物免疫
  • 1.4.抗DON单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
  • 1.5.杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定
  • 2.结果与分析
  • 2.1.3-HS-DON的纯化与鉴定
  • 2.2.3-HS-DON与载体蛋白偶联结果
  • 2.3.小鼠血清效价测定
  • 2.4.杂交瘤细胞株建立
  • 2.5.杂交瘤细胞株的冻存及复苏
  • 2.6.单克隆抗体的大量制备
  • 2.7.杂交瘤细胞及单克隆抗体特性分析
  • 3.讨论
  • 3.1.DON免疫抗原的制备
  • 3.2.单克隆抗体制备过程中的几个重要环节
  • 3.3.杂交瘤技术
  • 3.4.单克隆抗体的大量制备
  • 第二章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇间接竞争ELISA检测方法的建立
  • 1.材料和方法
  • 1.1.材料、试剂及主要仪器
  • 1.2.间接竞争ELISA最佳工作条件的确定
  • 1.3.标准曲线的建立及添加回收试验
  • 2.结果与分析
  • 2.1.间接竞争ELISA最佳工作条件的确定
  • 2.2.标准曲线的建立及添加回收试验
  • 3.讨论
  • 3.1.关于对作为研究目标抗体的筛选
  • 3.2.关于以杂交瘤细胞腹水建立检测体系
  • 3.3.关于标准曲线的实用性
  • 3.4.关于检测样品的前处理
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读学位期间发表的论文目录
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].抗体制备与使用实验指南(生命科学实验指南系列)[J]. 遗传 2010(10)
    • [2].妊娠相关血浆蛋白A重组抗原表位分析及抗体制备[J]. 山东医药 2013(13)
    • [3].多克隆抗体制备方法的研究进展[J]. 中国草食动物科学 2012(S1)
    • [4].犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析[J]. 中国畜牧兽医 2020(03)
    • [5].单克隆抗体制备过程中的筛选问题[J]. 中学生物教学 2011(10)
    • [6].卵黄抗体制备影响因素及其在动物生产中的应用[J]. 中国饲料 2013(04)
    • [7].塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备[J]. 河南农业科学 2020(01)
    • [8].抗苗勒管激素的单克隆抗体制备与鉴定[J]. 分子诊断与治疗杂志 2020(02)
    • [9].多胺调节因子-1原核表达与多克隆抗体制备[J]. 生物技术 2016(06)
    • [10].噬菌体展示技术及其在抗体制备中应用的研究进展[J]. 南昌大学学报(医学版) 2014(02)
    • [11].黄曲霉毒素新型抗体制备研究进展[J]. 食品安全质量检测学报 2014(08)
    • [12].铜绿假单胞菌黏附素蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备[J]. 生物技术 2020(02)
    • [13].中华鳖白细胞介素17原核表达及多克隆抗体制备[J]. 浙江农业科学 2020(02)
    • [14].副溶血性弧菌多克隆抗体制备及应用[J]. 食品与发酵工业 2020(08)
    • [15].草鱼TAB1蛋白的原核重组表达及其抗体制备[J]. 安徽农业大学学报 2020(02)
    • [16].蓖麻肌动蛋白基因的克隆、抗体制备和表达分析[J]. 华北农学报 2020(03)
    • [17].人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析[J]. 中华男科学杂志 2017(01)
    • [18].“TSO思维课堂”模式下的生物教学环节—以《单克隆抗体制备》为例[J]. 中国教师 2016(02)
    • [19].CD14蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备[J]. 现代生物医学进展 2020(19)
    • [20].草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒NS66抗体制备及应用[J]. 微生物学通报 2020(01)
    • [21].RIK蛋白的重组表达、多克隆抗体制备及其功能的初步研究[J]. 免疫学杂志 2016(05)
    • [22].治疗性抗体制备的研究进展[J]. 海南医学 2013(22)
    • [23].抗PⅠNP单克隆抗体制备及应用[J]. 云南大学学报(自然科学版) 2020(S2)
    • [24].人源性EGFL6的重组表达及多克隆抗体制备研究[J]. 免疫学杂志 2013(06)
    • [25].水稻未知功能结构域基因OsDUF6的抗体制备[J]. 福建农业学报 2020(02)
    • [26].单克隆抗体制备的筛选过程及意义[J]. 吉林农业 2014(17)
    • [27].小鼠抗人ABHD16A多克隆抗体制备[J]. 河南农业大学学报 2020(02)
    • [28].水痘-带状疱疹病毒糖蛋白N的单克隆抗体制备及初步研究[J]. 病毒学报 2017(03)
    • [29].抗人胱抑素C单克隆抗体制备及免疫检测体系建立[J]. 卫生研究 2017(04)
    • [30].类泛素化蛋白NEDD8单克隆抗体制备[J]. 中国动物传染病学报 2019(06)

    标签：;  ;  ;  

    抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体制备及其检测方法的建立
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2025 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5