降解纤维素产乙醇厌氧菌群的筛选鉴定及重组β-半乳糖苷酶的性质分析

论文摘要

随着石油、天然气等不可生资源的逐渐枯竭,以可再生纤维素制取乙醇逐渐成为当今世界研究的热点之一。利用纤维素生产乙醇的瓶颈是缺乏高效的降解纤维素产乙醇菌株以及成本偏高。传统的采用化学工艺降解纤维素,反应条件苛刻,对环境污染严重。因此筛选和改造发酵纤维素原料产乙醇的微生物是纤维素生物转化燃料乙醇的关键。本研究从永泰70℃温泉中富集优化出一个能降解纤维素的厌氧嗜热菌群YTY-70,通过条件优化测的该菌群最适生长温度为70℃,最适生长pH值为7.0,以滤纸为碳源的培养基中,该菌群的生长密度在72小时后达到最大值。在菌群生长条件优化时,本次实验以滤纸作为培养基的碳源,并在测OD值时先用快速滤纸将菌液过滤,尽可能的除去影响OD值的杂质。确定菌群生长的最适条件后,在最适条件下分别以CMC、滤纸、甘蔗渣、平菇筒为碳源,培养一周后用气相色谱测量发酵液中的乙醇,测的乙醇的含量分别为：0.124mL/L,0.127mL/L,0.122mL/L,0.124mL/L。提取菌群的总DNA,用16S引物扩增其保守序列,将片段连接到PMD-18T载体,转化到大肠杆菌中,经验证后挑去阳性克隆子外送检测。检测结果显示,该菌群中绝大部分菌属于Caldicellulosiruptor菌属。该菌属的细菌不但可以降解纤维素产乙醇,还可以产氢气、乙酸、高温纤维素酶、半乳糖苷酶等,具有良好的研究与应用价值。嗜热菌体内存在着独特的耐高温代谢途径和耐高温酶,一些来自嗜热菌的热稳定性的酶也已经相继被分离出来。但嗜热菌的培育条件较为严格、生长速度较慢,酶系复杂且产酶水平低,对乙酸等副产物的耐受性较差,从而阻碍了嗜热菌在工业生产中的大规模应用。本研究以分离自永泰70温泉的嗜热厌氧菌群YTY-70总基因组为模板,经测序对比后,设计β-半乳糖苷酶基因的引物,成功克隆出了热稳定β-半乳糖苷酶的基因。将基因与pGEX—4T-2连接,转化大肠杆菌构建了重组菌,通过培养和IPTG诱导,β-半乳糖苷酶获得了高效表达。用Glutathione SepHarose4B亲和纯化GST—β-半乳糖苷酶融合蛋白,获得大约2.19mg的GST—β-半乳糖苷酶融合蛋白并对其酶学性质进行了研究。研究表明,该重组酶的最适反应温度为75℃,最适反应pH值为7.0,反应温度范围非常广泛,在50-90℃均能发挥良好的酶活力。金属离子Ba2+、K+、Na+、Mg2+、Zn2及EDTA对该重组酶的酶活有轻微的抑制作用（1.4%-4.4%）。Fe2+、Ca2+对该重组酶的酶活有不同程度的促进作用。在最适反应条件下,该酶的比酶活高达260U/mg。通过分析其编码的氨基酸序列可知,该酶属于糖苷水解酶类第一家族。通过与其他菌属耐热β-半乳糖苷酶比较发现,该酶与其他菌属的β-半乳糖苷酶同源性较低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 纤维素的组成和结构特点
• 1.2 降解纤维素微生物的种类
• 1.3 纤维素乙醇的研究进展
• 1.4 嗜热菌在纤维素乙醇中的应用
• 1.5 来自嗜热菌的热稳定性酶
• 1.6 β-半乳糖苷酶的研究进展
• 1.6.1 β-半乳糖苷酶的来源
• 1.6.2 热稳定性β-半乳糖苷酶
• 1.6.3 β-半乳糖昔酶的应用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 YTY-70菌群的分析鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 基本方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 滤纸条降解观察
• 2.2.2 菌群革兰氏染色
• 2.2.3 菌群最适温度的确定
• 2.2.4 菌群最适pH值的确定
• 2.2.5 菌群的生长曲线
• 2.2.6 发酵液乙醇的含量测定
• 2.2.7 菌群总DNA的提取
• 2.2.8 16S rDNA保守序列的扩增
• 2.2.9 酶切验证结果
• 2.2.10 系统进化树及菌群结构
• 2.3 小结
• 第三章 热稳定β-半乳糖苷酶基因的克隆表达纯化及性质分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 热稳定β-半乳糖苷酶基因序列扩增
• 3.2.2 目的基因与表达载体连接及酶切验正
• 3.2.3 β-半乳糖苷酶基因的序列分析
• 3.2.4 重组热稳定β-半乳糖苷酶的表达
• 3.2.5 重组热稳定β-半乳糖苷酶的纯化
• 3.2.6 重组β-半乳糖苷酶的酶学性质分析
• 3.3 小结
• 第四章 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间待发表的论文
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 致谢