马生长激素（GH）基因序列、分子进化及其多态性的研究

论文题目: 马生长激素（GH）基因序列、分子进化及其多态性的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 张焱如

导师: 芒来

关键词: 生长激素基因,克隆,分子进化,多态性

文献来源: 内蒙古农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究以不同品种马为研究对象,利用 PCR 技术,首次成功地克隆了 6 个品种马的生长激素基因 1923bp 的片段(GenBank 登录号:AY837571),包括全部外显子和内含子。测序后,对其序列结构、核苷酸组成及所编码的氨基酸进行了初步研究,并利用 DNAMAN、DNAStar、Mega2.1、PAUP4.0 等生物学软件,构建了马 GH 基因进化树,同时对各品种马 GH 基因序列进行了 PCR-SSCP 和 PCR-RFLP 分析。研究结果表明: 1、马 GH 基因含有 5 个外显子和 4 个内含子,5 个外显子大小分别为:10 bp、161 bp、117 bp、162 bp 和 201 bp;4 个内含子大小分别为 253 bp、213 bp、199 bp 和 272 bp。外显子数目、大小、位置与哺乳类其他物种相比,表现出高度保守性。 2、马 GH 基因序列核苷酸组成富含 GC(60%以上),且外显子 GC 含量(61%)明显高于 5’端和 3’端的非编码区。编码氨基酸的密码子不同位点 GC 含量也有显著差异,表现为第一、第三位碱基富含 GC,且第一位碱基的 GC 含量接近于全序列,第三位碱基 GC 含量远高于其它位点,达 84.1%,第二位碱基富含 AT。密码子碱基组成的差异因物种不同而异,具有种属特异性。 3、马 GH 基因外显子在编码氨基酸时,对同义密码子的使用表现有强烈的偏好性。不同物种对同义密码子使用的偏倚程度与偏好类型各不相同,也具有种属特异性。 4、马 GH 基因所编码的蛋白质中,20 种氨基酸的含量差异很大。亮氨酸(L)含量最高,达 14.28%;色氨酸(W)最低,为 0.93%。极性氨基酸酸含量(54.99%)高于非极性氨基酸(45.01%)。此外,半胱氨酸(C)的含量与其他哺乳类完全一样,均为 5 个,而且半胱氨酸的位置在不同物种中高度保守,说明半胱氨酸对维持 GH 的空间结构起到极其关键的作用。 5、马 GH 氨基酸位点的进化演变表明,马各品种间氨基酸差异数很少,仅有 0～5个氨基酸不同,说明相互间的进化距离很小。马与人及其它动物相比较,进化距离由近至远依次为猪、狗、牛、羊和人。 6、采用不同方法构建的马 GH 基因进化树表明,马 GH 基因不同区段进化速率不同,外显子区域进化速率最慢;内含子序列中碱基变异频繁,进化较快。进化树分枝显示,乌珠穆沁马、三河马、锡尼河马三个品种与其它品种间已形成明显的进化分歧。 7、PCR-SSCP 分析结果表明,在所检测的 5’端侧翼区、第一内含子、第二外显子和第五外显子四个位点中,仅第五外显子检测到多态,该多态位点由 A 和 B 两种等位基因控制。GH 基因第 1719bp 处一个 T→C 的突变和 1743 处 G→A 的突变,导致等位基因 B 变为等位基因 A。除纯血马外,A 基因在各品种中均为优势等位基因,B 基因为纯血马的优势基因。在此多态位点,乌珠穆沁马、乌审马和巴尔虎马处于 Hardy-Weinberg 平衡状态,纯血马、三河马和锡尼河马则未达到 Hardy-Weinberg 平衡状态。 8、对马 GH 基因全序列进行 PCR-RFLP 分析,采用四种限制性内切酶 BstⅪ、HindⅢ、SmaⅠ和 StuⅠ进行酶切,仅后两种酶检测到多态。SmaⅠ位点出现 A、B 两种等位基因,在 GH 基因序列的 1256bp 处发生 T→C 的转换,导致产生 1 个 SmaⅠ的酶切位点 CCC↓GGG,从而使基因型 AA 变为基因型 BB。在该位点乌审马 B 基因频率最高,为 0.667,纯血马 A 等位基因频率最高,达 0.643。乌审马、乌珠穆沁马和巴尔虎马处于 Hardy-Weinberg 平衡状态,锡尼河马、三河马和纯血马处于非平衡状态。 StuⅠ位点存在 C 和 D 两种等位基因,在 GH 序列的 1353bp 处发生了 C→T的变化,导致产生一个 StuⅠ的酶切位点 AGG↓CCT,使基因型 CC 变为基因型DD;C 基因为锡尼河马的优势等位基因,基因频率达 0.63,D 基因是纯血马的优势等位基因,基因频率为 0.74。该位点上,只有乌审马处于 Hardy-Weinberg平衡状态,其余品种均未达到 Hardy-Weinberg 平衡。 9、本研究首次对几个品种马 GH 基因序列、分子进化及其多态性进行了初步研究,研究结果对今后合理利用、开发和保护我国马种的遗传资源具有一定的指导意义。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

一、文献综述

1 、马的简介

1.1 马的起源与进化研究

1.2 马的品种及分类

1.3 马的经济价值

1.4 马的遗传学与进化研究

2、生长激素与生长激素基因的研究进展

2.1 生长激素的结构特点与信号转导途径

2.2 生长激素的生物学功能

2.3 生长激素的作用特点

2.4 生长激素基因的定位与结构

2.5 生长激素基因的表达与调控

2.6 生长激素基因多态性的研究

3 、生物进化理论研究的新进展

3.1 进化的综合学说

3.2 中性学说的产生与分子进化学说的发展

3.3 进化的综合学说与分子进化间的关系

3.4 分子进化的研究方向

3.5 分子进化研究的趋势

4 、本研究的目的与意义

二、材料与方法

1 、实验材料

1.1 材料来源

1.2 所用仪器设备

1.3 主要试剂

1.4 主要试剂和溶液的配制

2 、实验方法

2.1 基因组DNA的提取与检测

2.2 PCR反应

2.3 克隆与测序

2.4 PCR—RFIP分析

2.5 PCR—SSCP分析

3 、数据分析方法

3.1 马生长激素基因系统发育关系分析

3.2 基因多态性的统计方法

三、结果与分析

1 、马GH基因序列的扩增与鉴定

1.1 基因组DNA的提取与检测结果

1.2 PCR扩增结果

1.3 马GH基因PCR产物纯化结果

1.4 重组质粒的PCR鉴定

2 、马GH基因序列的分析

2.1 马及其他物种 GH 基因序列的一级结构分析

2.2 马 GH 基因5’调控区分析

2.3 GH 基因核苷酸组成分析

2.4 GH 基因密码子核苷酸组成分析

2.5 核苷酸变异模式分析

3 、GH 基因外显子氨基酸序列分析

3.1 氨基酸序列比对分析

3.2 氨基酸组成与含量分析.

3.3 密码子使用频率与偏好性分析

3.4 氨基酸序列的进化分析

4 、GH 基因系统发育分析

4.1 GH基因树的构建

4.2 GH基因树的分析

5 、GH 基因多态性分析

5.1 马 GH 基因四个位点 PCR—SSCP 分析

5.2 马 GH 基因序列 PCR—RFIP 分析

5.3 不同位点的群体遗传学分析

四、讨论

1、采样与DNA提取

1.1 采样

1.2 DNA的提取

2、PCR扩增

2.1 引物

2.2 P C R 反应条件

3、PCR—SSCp分析的影响因素

3.1 PCR产物大小

3.2 PCR产物纯度与浓度

3.3 聚丙烯酰胺凝胶浓度与制备

3.4 变性温度与时间

3.5 电泳温度与电压

3.6 SSCP基因型的确定

4、PCR—RFIP分析的影响因素

4.1 PCR产物的纯度与产率

4.2 限制性内切酶用量、酶切时间与温度

4.3 电泳检测方法

5 、马GH基因序列结构、组成特点

6 、产生密码子多态性与偏好性的原因

6.1 密码子多态性的产生

6.2 产生密码子偏好性的原因

7、从马 GH 基因分子进化树分析其品种分化

7.1 GH基因树分析

7.2 各品种马的分枝地位

8、马 GH 基因不同多态位点的群体遗传学分析

8.1 不同位点等位基因的分步

8.2 群体遗传多样性分析

9 、关于马遗传资源的保护

五、结论

致谢

参考文献

附录

作者简介

发布时间: 2005-07-18

参考文献

[1].猪肝脏组织中lincRNA的分子进化和甲基化模式研究[D]. 李岑岑.华中农业大学2017
[2].牛亚科家畜基于结构基因的分子进化特征与分子钟学说检验[D]. 耿荣庆.扬州大学2008
[3].牛Sry基因核心启动子定位及其基因功能研究[D]. 韩凤桐.东北农业大学2008

马生长激素（GH）基因序列、分子进化及其多态性的研究

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