探讨核糖体蛋白RPL36的突变对酵母细胞生长的影响

论文摘要

真核生物核糖体生物发生（biogenesis）是一个高度复杂和协同进行的过程。近年研究显示许多核糖体蛋白参与了pre-rRNA的剪切成熟（processing）、核糖体亚基的组装和核糖体的翻译功能。但是对核糖体蛋白影响核糖体生物发生及其功能的详细机制仍不清楚。最近发表的一项以酵母核糖体蛋白RPS14为对象的研究，为我们探讨核糖体蛋白对核糖体生物发生的影响提供了一个模型。在本课题中，我们利用同源重组的方法将酵母菌中内源的两个RPL36基因（RPL36A和RPL36B）敲除，同时为了使敲除菌株能够存活，我们转入了一个含有野生型RPL36B基因的Ura标记质粒。然后应用质粒更换的技术将七个突变RPL36B基因导入缺失菌株以替换含野生型RPL36B基因的Ura标记质粒，使得突变的RPL36蛋白成为细胞内唯一的RPL36蛋白来源。在此背景下，我们检测到四个RPL36蛋白的突变明显影响了酵母细胞生长。今后我们将利用这些具有表现型的突变菌株为材料，探讨RPL36蛋白的突变对pre-rRNA的剪切成熟、核糖体亚基的组装以及对核糖体功能的影响。这些知识的积累，将有助于我们更深入地了解核糖体蛋白在真核生物核糖体结构和功能中扮演的角色。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 核糖体简介
• 1.2 真核生物核糖体的形成
• 1.3 酵母中pre-rRNAs的成熟
• 1.4 核糖体蛋白在rRNA的剪切成熟和核糖体功能中扮演的角色
• 1.5 本课题研究内容、研究目标及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒及菌种
• 2.1.2 酶及化学试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 提取酵母基因组DNA
• 2.2.2 引物设计与PCR扩增
• 2.2.3 DH5a、ER2925、XL1-Blue感受态细胞的制备与转化
• 2.2.4 质粒DNA的提取
• 2.2.5 利用同源重组构建RPL36内源基因缺失的突变酵母菌种
• 2.2.6 在体外构建RPL36基因点突变
• 2.2.7 Plasmid shuffling
• 2.2.8 Spotting assay
• 第3章 结果与分析
• 3.1 构建RPL36A或RPL36B基因删除片段
• 3.1.1 RPL36A基因删除片段的构建
• 3.1.2 RPL36B基因删除片段的构建
• 3.2 构建并筛选基因组中内源RPL36基因缺失的突变酵母菌种，并用菌落PCR验证
• 3.2.1 敲除酵母基因组中内源RPL36A或RPL36B基因
• 3.2.2 敲除内源RPL36A或RPL36B基因缺失菌株中的剩下的RPL36B或RPL36A基因
• 3.3 应用ClustalW软件分析比对不同物种间RPL36蛋白的保守氨基酸位点
• 3标签的野生型RPL36B基因的构建'>3.4 （HA）₃标签的野生型RPL36B基因的构建
• 3.5 RPL36基因保守氨基酸位点的突变
• 3.6 利用spotting assay方法检测RPL36蛋白的突变对细胞生长的影响
• 第4章 讨论与展望
• 4.1 酵母基因敲除的思考
• 4.2 核糖体蛋白RPL36突变影响细胞生长机理的分析
• 4.3 对今后工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录