用DefH9-iaaM和TERF1基因转化糖橙的研究

论文摘要

柑橘是世界第一大水果,2006年,世界柑橘年产量1.1亿吨,面积10730万亩,年贸易额达65亿美元,堪称世界第一大水果。我国是柑橘的重要原产地之一,柑橘资源丰富,优良品种繁多,栽培历史悠久。2006年我国柑橘面积已超过170万公顷,占世界柑橘总面积的23%,居世界第一位,产量近1800万吨,居世界第二位。柑橘已经成为我国南方经济的支柱产业。但是我国柑橘产业虽有一定的基础,但与世界柑橘生产先进国家相比,差距还较大。特别是在品种选育方面还需进一步加强。柑橘是木本植物,存在童期长、珠心胚干扰、高度杂合、遗传背景复杂等缺点,导致常规育种的方法不仅存在很大的盲目性,而且育种效率低。随着生物技术的发展,与传统育种方法相比,利用基因工程培育新品种不受基因型限制,目的基因来源广泛,可以定向地改变目标性状等优点,采用成年态材料作为转化受体,还可以大大缩短育种周期,研究外源基因对植物开花和结果的影响。糖橙由于纯甜似蜜,深受消费者的喜爱。但糖橙种籽较多,目前还没有无核的糖橙品种,同时细菌病害和真菌病害危害较多,增强抗病性也是主要育种目标之一。因此本项研究的目的是建立糖橙的高效再生转化体系和成年态再生转化体系,在此基础上把defH9-iaaM基因,即来自金鱼草的iaaM基因和来自根癌农杆菌的DefH9启动子导入柑橘中,以期望获得具有单性结实能力的新种质。其次,将通过酵母单杂交从番茄中克隆的转录因子TERF1导入糖橙中,期望能够获得对柑橘主要病害如溃疡病、炭疽病有广谱抗性的新种质。通过对转基因的种质进行转基因表达、形态学观测和抗病性等方面的研究,综合评价转基因育种对品种改良方面的作用。本试验获得主要研究结果如下:（1）建立糖橙实生态的再生培养体系。以30d苗龄的糖橙实生态节间茎段不定芽分化率较高,暗培养可以显著的提高不定芽的再生率。筛选出适宜实生态节间茎段再生的不定芽诱导的培养基:MS+5mg/L 6-BA;不定芽增殖培养基:MS+1.0 mg/L 6-BA+NAA 1.0 mg/L;生根培养基:MS+0.5 mg/L NAA。其中采用两步法诱导不定芽再生和生根效果较好。（2）建立了成年态糖橙的不定芽再生体系。用改良的消毒方法G,即采枝梢前一周,每隔一天下午,于温室中将要采取的枝梢用10%的次氯酸钠溶液擦拭一遍,共擦拭4次,且供试植株须隔离放置。再采用70%的酒精处理30s,再用1%的升汞溶液加几滴吐温浸泡24min,无菌水冲洗4次进行消毒。可显著的提高成年态节间茎段的成活率。成年态节间茎段培养基以6-BA 5 mg/L+2,4-D 2 mg/L+IAA 2mg/L培养的效果最好,茎段愈伤诱导率和不定芽诱导率最高可达17.8%和2.87个。对成年态不定芽的嫁接进行了研究,认为经过改良的“⊥”压法成活率较高,可以达到78.94%。（3）建立了将DefH9-iaaM基因和TERF1基因两个外源基因导入到实生态糖橙的转化体系。研究了不同根癌农杆菌对糖橙实生态节间茎段的转化率,结果显示EHA105的转化能力强于LBA4404。浸染时间以15min为宜。针对糖橙实生态节间茎段和成年态节间茎段再生能力的差异性,认为卡那霉素浓度为100mg/L时适合对糖橙实生态节间茎段再生不定芽进行筛选,卡那霉素浓度为30mg/L时适合对柑橘成年态节间茎段再生不定芽进行筛选,通过PCR鉴定,不定芽的转化率高达29.4%。（4）通过PCR鉴定,结果显示以获得了6株转DefH9-iaaM基因植株,通过形态学的研究证实,这6株转基因植株在株高、节间长度、叶面积方面比对照有明显的增长、增宽现象。利用PCR、RT-PCR、Southern杂交技术对转TERF1基因的糖橙进行了分子检测,结果显示,共获得了7株转TERF1基因植株株系。通过对3,7,11号植株的Southern杂交,结果显示TERF1基因已经成功的整合到了糖橙的基因组中,且均为为单拷贝插入。从植株形态特征表现上看,转TERF1基因的植株与未转化植株无显著差异。（5）对转TERF1基因的糖橙进行离体溃疡病和炭疽病的接种试验。通过对病斑大小和数量的分析,结果表明1,3,7,8,11号株系对柑橘溃疡病和炭疽病表现出广谱抗性。接种溃疡病病害时,3号株系对溃疡病的抗病性最强,发病级别为0级。其余转基因植株溃疡病的发病率比对照植株下降了70%左右。进行炭疽病的离体接种7d后发现,转基因植株的叶片基本上都表现出针孔处病斑减小。从照片上可以看到3号和7号转TERF1基因糖橙叶片不仅基本上观察不到炭疽病的典型病斑,而且叶片仍然可以保持翠绿。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 柑橘育种的研究进展
• 1.1 柑橘常规育种研究
• 1.2 柑橘转基因育种研究
• 1.2.1 再生体系的建立
• 1.2.2 基因转化的方法研究
• 1.2.3 导入的基因
• 1.3 柑橘转基因研究存在的主要问题及今后发展趋势
• 1.3.1 建立稳定、高效的再生转化体系
• 1.3.2 成年态再生体系的建立
• 1.3.3 柑橘转基因育种的发展趋势
• 2 转录因子研究进展
• 2.1 bZIP类转录因子
• 2.2 WRKY类转录因子
• 2.3 MYB类转录因子
• 2.4 ERF类转录因子
• 2.4.1 PR蛋白
• 2.4.2 ERF类转录因子的研究进展
• 2.5 转录因子的作用
• 2.5.1 提高植物抗寒性
• 2.5.2 提高植物抗旱和耐盐性
• 2.5.3 提高植物抗病性
• 3 单性结实研究进展
• 4 本研究的主要目的和意义
• 5 主要技术路线
• 第二章 糖橙实生态节间茎段再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法和培养基
• 1.2.1 不同的苗龄对糖橙实生茎段不定芽分化情况的影响
• 1.2.2 不同暗培养时间对糖橙实生茎段不定芽分化情况的影响
• 1.2.3 不定芽诱导培养基
• 1.2.4 增殖培养基
• 1.2.5 生根培养基
• 2 结果与分析
• 2.1 不同苗龄的节间茎段对不定芽再生的影响
• 2.2 不同暗培养时间对不定芽再生的影响
• 2.3 不同6-BA浓度对实生态糖橙茎段的再生影响
• 2.4 改良的糖橙实生态茎段不定芽的再生方法
• 2.5 不定芽的增殖培养
• 2.6 不同浓度IBA、GA3和NAA对糖橙不定芽生根的影响
• 3 讨论
• 3.1 不同培养条件对不定芽诱导的影响
• 3.2 6-BA对不定芽诱导的影响
• 3.3 不同激素组合对不定芽增值和生根的影响
• 4 小结
• 第三章 糖橙成年态节间茎段再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料的选择
• 1.2 外植体消毒的方法
• 1.3 不同暗培养时间对柑橘成年态节间茎段的诱导
• 1.4 不同激素浓度对成年态茎段再生的影响
• 1.5 不定芽的嫁接
• 2 结果与分析
• 2.1 不同灭菌方法对灭菌效果的影响
• 2.2 不同暗培养时间对成年态的诱导
• 2.3 不同激素浓度对糖橙成年态不定芽再生的影响
• 2.4 不同嫁接方法对糖橙成年态不定芽成活率的影响
• 3 讨论
• 3.1 不同消毒方法对降低柑橘成年态枝条污染率的影响
• 3.2 不同培养对柑橘实生态茎段再生率的影响
• 3.3 不同嫁接方法对柑橘不定芽嫁接成活率的影响
• 4 小结
• 第四章 糖橙转化体系的建立和DefH9-iaaM基因的导入
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试验主要试剂和仪器
• 1.2.1 试验主要试剂
• 1.2.2 试验主要仪器
• 1.2.3 主要培养基配方和培养方式
• 1.3 卡那霉素筛选浓度的确定
• 1.4 农杆菌菌株与质粒
• 1.5 农杆菌的转化
• 1.6 分子检测
• 2 结果与分析
• 2.1 实生态糖橙茎段卡那霉素的筛选
• 2.2 成年态糖橙茎段卡那霉素的筛选
• 2.3 农杆菌转化过程中浸染时间的优化
• 2.4 再生和嫁接
• 2.5 DNA质量检测
• 2.6 PCR检测
• 2.7 转DefH9-iaaM基因糖橙的形态学观测
• 3 讨论
• 3.1 卡那霉素的筛选
• 3.2 农杆菌浸染时间对转化率高低的影响
• 3.3 PCR检测和形态学分析
• 4 小结
• 第五章 将TERF1基因导入糖橙的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料的准备
• 1.2 培养基和试剂的准备
• 1.3 农杆菌菌株的准备
• 1.3.1 质粒的提取
• 1.3.2 EHA105感受态细胞的制备
• 1.3.3 感受态细胞的转化
• 1.4 PCR鉴定
• 1.5 实生糖橙茎段的转化和再生
• 1.6 分子检测
• 1.7 Southern杂交检测
• 1.7.1 探针的标记
• 1.7.2 DNA的大量提取及酶解
• 1.7.3 DNA的电泳和变性
• 1.7.4 转膜
• 1.7.5 预杂交
• 1.7.6 杂交
• 1.7.7 显影和定影
• 2 结果和分析
• 2.1 质粒的提取和检测
• 2.2 阳性转化菌落的筛选
• 2.3 含有TERF1基因的两种农杆菌菌株浸染能力的比较
• 2.4 抗性芽的嫁接
• 2.5 拟转化植株的分子鉴定
• 2.6 拟转TERF1基因糖橙的形态学分析
• 2.7 RT-PCR检测
• 2.8 Southern杂交
• 2.8.1 探针的检测
• 2.8.2 DNA的检测和酶切检测
• 2.8.3 Southern杂交检测
• 3 讨论
• 3.1 农杆菌质粒的提取和导入
• 3.2 不同农杆菌菌株对糖橙茎段的浸染能力
• 3.3 分子检测
• 4 小结
• 第六章 转TERF1基因糖橙的抗病性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 病原菌的活化
• 1.3 溃疡病的接种方法
• 1.4 炭疽病的接种方法
• 1.5 溃疡病的分级标准和抗病性评价
• 1.6 炭疽病的分级标准和抗病性评价
• 1.7 发病率的计算方法
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因株系叶片对柑橘溃疡病的离体检测结果
• 2.2 转基因株系叶片对柑橘炭疽病的离体检测结果
• 3 讨论
• 3.1 转基因植株对溃疡病的接种反应
• 3.2 转基因植株对炭疽病的接种反应
• 4 小结
• 主要结论与创新之处
• 1 主要结论
• 2 创新之处
• 3 下一步工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历