论文摘要
研究背景近年来的研究表明,β1肾上腺素能受体（β1-adrenoceptor,β1-AR）细胞外第二环（the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor,β1-AR-ECⅡ）自身抗体及其自身免疫机制可能参与了原发型扩张性心肌病、风湿型性脏病、Chagasic病、原发性心电紊乱病等多种心脏疾病的发病过程。β1肾上腺素能受体细胞外第二环自身抗体（autoantibodies against the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor,β1-AA）在心脏病发生、发展中的病理生理作用日益受到研究者的关注。之前的研究均是通过采用与人β1-AR-ECⅡ表位肽段序列相一致的合成肽段免疫动物得到的结果,这种主动免疫模型有两个主要的不足：其一,由于该模型是用抗原诱导动物体内产生相应抗体,所以无法控制动物体内相应抗体（即β1-AA）的水平,结果导致动物模型血清中β1-AA的水平远远高于临床病人血清中的实际值；其二,用该模型得出的研究结果不能排除抗原肽段对机体的损伤作用。因此,完善现有的动物模型以更好地模拟临床,成为研究β1-AA在心功能不全等疾病中病理生理学意义的基础。对β1-AA的进一步研究发现,该自身抗体具有类β-AR激动剂样的作用,可以导致急性分离的正常动物心肌细胞内Ca2+的水平增加。然而,β1-AA长期存在是否会影响心肌细胞胞内Ca2+水平尚不清楚,而后者是临床上能否将Ca2+作为β1-AA导致心功能不全治疗的靶点。研究目的1.建立并完善β1-AA被动免疫大鼠模型,使动物模型血清中β1-AA水平与临床心功能不全患者血清中β1-AA水平相匹配。2.利用上述模型观察β1-AA长期存在对大鼠心肌细胞胞内游离钙水平的影响及作用途径。材料和方法1.抗人β1肾上腺素能受体自身抗体（β1-AA）的制备1.1抗人β1-AR抗原肽段的合成：按照人β1-AR-ECⅡ的功能表位肽段（197-223,H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A,人鼠同源性100%,由吉尔生化上海有限公司合成,纯度大于95%）。合成的肽段储存于-20℃备用,用于后续血清抗体的定性、定量和血清抗体的功能测定。1.2β1-AA抗体制备：使用上述抗原肽段对Wistar大鼠（8周龄,体重160-180g,n=20）进行为期8周的主动免疫,制备β1-AA血清,其效价用SA-ELISA （Streptavidin-enzyme linked immunosorbent assay）方法检测。利用MAb Trap Kit试剂盒对血清中的β1-AA进行提取和纯化。纯化后的抗体蛋白液先经PAGE凝胶电泳检测其纯度,然后使用BCA试剂盒对提取液进行蛋白定量。2.被动免疫大鼠模型的建立2.1被动免疫方案：按照预实验的结果,将纯化的β1-AA以0.7μg/g的剂量通过尾静脉注入正常大鼠体内,每2周加强免疫一次,共免疫40周。对照组以0.7μg/g的剂量通过尾静脉注入阴性IgG,免疫程序和检测方法同上。2.2大鼠心功能的测定：取被动免疫40周大鼠,称重后经腹腔注射乌拉坦（1g/kg, i.p）麻醉,经右颈总动脉行左心室插管,待出现左心室标致性波形（图1）后,稳定15-20分钟,用BL-410生物信号记录分析系统记录各心功能参数,包括左心室收缩压（Left Ventricular Systolic Pressure, LVSP）、左心室舒张压（Left Ventricular Diastolic Pressure, LVDP）、室内压上升的最大速率（+dp/dtmax）和室内压下降的最大速率（-dp/dtmax）。3.激光共聚焦显微镜对被动免疫末期大鼠心肌细胞胞内游离钙的测定3.1心肌细胞的分离：取被动免疫40周大鼠,用1%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉,用Langendorff灌流装置经主动脉逆行灌流酶解心脏为单个心肌细胞,放置于高钾KB（配方见溶液配制）液中,静置2-4小时后进行实验。3.2激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, LSCM）测定心肌细胞胞内游离钙水平：加入有钙台式液（配方见溶液配制）将分离的单个心肌细胞悬液复钙,负载Fluo-3/AM荧光指示剂后,加入共聚焦专用皿,置于倒置荧光显微镜下观察。每只大鼠取10个视野,选择杆状、细胞膜完整、形态好的细胞进行测定,结果用LSM510图像分析软件进行分析。4.离子成像系统对正常大鼠心室肌细胞胞内游离钙的测定取健康Wistar大鼠,用上述细胞分离法获得单个心肌细胞悬液。负载Fura-2/AM荧光指示剂后,加入离子成像系统的灌流槽内中,置于倒置荧光显微镜下,分组进行测定：（1）正常对照组：（Tyrode, n=6）,正常台氏液；（2）阴性IgG组：（Negative IgG,n=6）,给予阴性IgG；（3） Isoprenaline组：（Isoprenaline, n=6）,给予1μmol/L的β-AR激动剂异丙肾上腺素（Isoprenaline）;（4）β1-AA组：（β1-AA,n=6）,给予0. 1μmol/L的β1-AR自身抗体；（5）β1-AA加β1-AR拮抗剂比索洛尔（Bisoprolol）组：（β1-AA+Bisoprolol, n=6）,同时给予0.1μmol/L的β1-AA和1μmol/L的Bisoprolol; （6）拮抗剂Bisoprolol组:（Bisoprolol,n=6）,给予1μmol/L的Bisoprolol；（7）β-AA加β1-AR-ECⅡ肽段组：（β-AA+β1-AR-ECⅡ,n=6）,同时给予0.1μmol/L的β1-AA和1μmol/L的β1-AR-ECⅡ肽段；（8）β1-AR-ECⅡ肽段组：（β1-AR-ECⅡ,n=6）,给予1μmol/L的β1-AR-ECⅡ肽段。观察各组心肌细胞胞内游离钙的变化,并与Isoprenaline的作用进行比较。结果1.利用β1-AR-ECⅡ功能表位肽段主动免疫大鼠获得β1-AA1.1主动免疫过程中大鼠体内β1-AA水平升高免疫组大鼠从初次免疫2周后,血清中已有β1-AA的出现,并且滴度迅速升高,在8周时达高峰,且明显高于同期对照组（OD值为2.99±0.14vs.0.43±0.12,P<0.05,图2）,表明主动免疫成功。1.2β1-AA蛋白定性及定量测定结果PAGE凝胶电泳检测结果显示,纯化后的抗体在电泳时,仅有一条带出现,分子量为160KDa左右,与IgG标准品相一致（图3）,表明纯化结果理想。同时,经BCA试剂盒测定提取液中蛋白浓度（表1）。2.利用纯化后β1-AA成功建立被动免疫大鼠模型2.1被动免疫过程中大鼠体内β1-AA水平维持与临床匹配范围将β1-AA被动转运入正常大鼠体内后,动物血清中β1-AA水平逐渐升高,在被动免疫第16周时达到高峰,此后抗体水平开始缓慢下降。各组内8、16、32、36、40周比较无统计学差异,但和同一时间对照组相比有显著差异（P<0.001,P<0.05,图5）。在整个被动免疫过程中,免疫大鼠血清中β1-AA水平维持在0.19±0.01-0.22±0.02之间,与临床心脏疾病患者血清中抗体水平接近。2.2被动免疫末期出现大鼠在体心功能下降β1-AA被动免疫第40周时,免疫组出现了在体心功能下降（图6）。其中,被动免疫组大鼠左心室室内压上升的最大速率（+dp/dtmax）、室内压下降的最大速率（-dp/dtmax）显著低于对照组（P<0.001,P<0.01）；左室舒张压（LVDP）显著高于对照组（P<0.001）；左室收缩压（LVSP）变化不明显,组间及组内比较均无统计学差异（P>0.05）。提示β1-AA的长期存在导致了大鼠心功能下降。3.β1-AA长期存在可使大鼠心肌细胞胞内游离钙水平升高3.1被动免疫末期大鼠心肌细胞胞内游离钙水平升高β1-AA被动免疫大鼠第40周时,采用高分辨率的成像清晰的能对细胞内探针的荧光进行准确的定量分析的LSCM进行测定。结果显示,免疫组单个心肌细胞胞内游离钙水平高于对照组约10倍（P<0.001,图7A,B）,提示β1-AA长期存在可以导致单个心肌细胞胞内游离钙水平升高。3.2β1-AA可以通过激活β1-AR途径升高心肌细胞胞内游离钙水平由于该研究课题需要长时间监测心肌细胞胞内游离钙水平,为保证实验过程中心肌细胞保持良好的状态,实验利用离子成像系统进行测定,借助灌流装置用不同处理组氧饱和液体进行持续灌流,来保证测定结果的可靠性。结果显示,β1-AA可以使正常大鼠心肌细胞胞内游离钙水平显著升高（图9A,B）,这一效应与β-AR激动剂Isoprenaline作用一致（图8A,B）。但是,与Isoprenaline不同的是β1-AA增加胞内游离钙的作用是持续的,可能具有不脱敏性（图8A,9A）。给予1μmol/Lβ1-AR选择性拮抗剂Bisoprolol后,可以几乎完全拮抗β1-AA对胞内游离钙升高的作用（图10A）；给予β1-AR-ECⅡ功能表位肽段后,可以逆转β1-AA升高胞内游离钙的作用（图10B）。结论1.用纯化的β1-AA长期被动免疫可建立与临床病人抗体水平匹配的心功能不全模型。2.β1-AA可通过激活β1-AR途径升高心肌细胞胞内游离钙的水平,这一作用与β-AR激动剂Isoprenaline一致。但与Isoprenaline不同的是,β1-AA升高胞内游离钙水平的作用可能具有不脱敏性。