D-泛解酸内酯水解酶的固定化研究

论文摘要

D-泛解酸内酯水解酶可以专一性拆分DL-泛解酸内酯,生成D-泛解酸。D-泛解酸是合成合成维生素类药物D-泛醇及神经营养药D-泛酸钙的前体。本文以本实验室筛选的高产D-泛解酸内酯水解酶的菌株腐皮镰孢菌（Fusarium proliferatum var. proliferatumAS3.4738）为材料发酵产菌丝体,研究了从菌丝体提取D-泛解酸内酯水解酶以及固定化该酶的方法,明确了固定化酶的酶学性质并对固定化酶的转化工艺条件进行了优化,从而为该酶的工业化应用奠定了基础。实验用液氮研磨法、高压均质法和超声破碎法对菌丝体进行破壁处理,结果显示三种方法处理所得的酶活提取率分别为：57.58%,56.97%和53.78%。然后进行超滤浓缩,粗酶液由0.013U/mL提高到0.04U/mL,酶活损失率为3.5%。实验选用了6种有代表性的树脂D-3520、D-152、D-380、N-KA9、AB-8和ES-V-1进行研究。通过实验发现D-380吸附D-泛解酸内酯水解酶的效果最好。用它固定化酶,酶活可达4U/g树脂,酶活回收率达到66.7%。通过比较戊二醛和THP的交联效果,发现戊二醛的交联效果优于THP。使用前者的固定化酶活是后者的4.76倍。优化的戊二醛固定化条件为：加酶量为6U/g树脂,吸附pH7.5,吸附温度30℃,吸附时间4h；戊二醛（终）浓度0.1%,交联时间1h,交联温度4℃。采用单因素的实验方法确定了固定化酶的酶学性质：固定化D-泛解酸内酯水解酶最适温度40℃,比游离酶提高了10℃；其热稳定性和pH稳定性均有一定的提高；固定化酶动力学常数Km为28.2mmol/L,比报道的D-泛解酸内酯水解酶的Km3.6mmol/L（DL-泛解酸内酯）增加6.8倍。采用单因素实验和正交实验结合的方法,优化了在最优条件制备的固定化酶水解DL-泛解酸内酯的条件。最适作用温度为35℃；最适作用pH为7.5；最适底物浓度为20%；最适固定化酶浓度为1%;摇瓶最佳转速为180r/min;最佳反应时间为12h。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 前言
• 1.1 D-泛解酸内酯水解酶的研究情况
• 1.2 D-泛解酸内酯及泛酸系列产品的概述
• 1.2.1 D-泛解酸内酯的概述
• 1.2.2 泛酸的概述
• 1.2.3 D-泛醇
• 1.2.4 D-泛硫乙胺
• 1.3 固定化酶及其载体的研究概况
• 1.3.1 固定化酶的简介
• 1.3.2 酶的固定化方法
• 1.3.3 固定化酶的应用
• 1.3.4 固定化酶载体简介
• 1.4 本课题立体依据与研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要药品
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验流程
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 菌丝体发酵培养
• 2.3.2 粗酶液的制备
• 2.3.3 树脂转型
• 2.3.4 载体选择方法
• 2.3.5 红外光谱的测定
• 2.3.6 酶的固定化方法
• 2.3.7 酶活测定方法
• 2.3.8 光学纯度的测定方法
• 2.3.9 泛解酸内酯和泛解酸的HPLC测定
• m的测定方法'>2.3.10 动力学常数K_m的测定方法
• 2.3.11 相对活力和剩余活力的定义
• 2.3.12 固定化酶底物水解反应各参数确定
• 3. 结果与讨论
• 3.1 D-泛解酸内酯水解酶提取方法的选择
• 3.2 超滤浓缩对酶活力的影响
• 3.3 固定化载体的选择
• 3.4 固定化前后树脂的红外光谱分析
• 3.5 以戊二醛为交联剂固定化条件的选择
• 3.5.1 加酶量的选择
• 3.5.2 吸附pH的选择
• 3.5.3 吸附时间的选择
• 3.5.4 吸附温度的选择
• 3.5.5 戊二醛浓度的选择
• 3.5.6 交联时间的选择
• 3.5.7 交联温度的选择
• 3.6 以THP为交联剂的固定化条件的选定
• 3.6.1 THP浓度的选择
• 3.6.2 加酶量的选择
• 3.6.3 固定化时间的选择
• 3.6.4 固定化pH的选择
• 3.7 两种交联剂固定化效果的对比
• 3.8 固定化D-泛解酸内脂水解酶的酶学性质
• 3.8.1 固定化酶的最适温度
• 3.8.2 固定化酶的热稳定性
• 3.8.3 固定化酶的最适pH
• 3.8.4 固定化酶的pH稳定性
• 3.8.5 固定化酶的储藏稳定性
• m值'>3.8.6 固定化酶的K_m值
• 3.9 固定化酶转化工艺的研究
• 3.9.1 温度对酶水解反应的影响
• 3.9.2 pH对酶水解反应的影响
• 3.9.3 底物浓度对酶水解的水解反应的影响
• 3.9.4 固定化酶的浓度对酶水解反应的影响
• 3.9.5 转速对酶水解的影响
• 3.9.6 水解反应时间对酶水解反应的影响
• 3.9.7 正交实验结果
• 3.9.8 固定化酶的操作稳定性
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士期间发表论文情况
• 8 致谢