产脂肪酶微生物的筛选及钙对其发酵产酶与酶学性质的影响

论文摘要

微生物脂肪酶作为一种重要的工业用酶,已经在工业中得到越来越广泛的应用;关于如何提高脂肪酶的产量和稳定性的研究一直以来都是国内外研究的热点。从自然界中筛选得到一株产脂肪酶的微生物,通过形态、生理生化和16S rDNA鉴定,确定其为不动杆菌属,定名为Acinetobacter sp. SYBC Li-2。采用硫酸铵沉淀和双水相萃取的方法分离纯化了SYBC Li-2脂肪酶。SYBC Li-2脂肪酶粗酶最终纯化了8.64倍,回收率为38.97%。经过SDS-PAGE电泳验证, SYBC Li-2脂肪酶只有一个亚基,分子量约为24.5 kDa。SYBC Li-2脂肪酶是金属结合酶,钙离子对脂肪酶有明显的激活作用,5mmol/L时可使酶活增加39.1%,但钙离子不是酶蛋白的活性必需因子。SYBC Li-2脂肪酶在40℃、50℃环境中稳定,在60℃的环境中不稳定,1 h后下降到原酶活的43%。SYBC Li-2脂肪酶在pH 7.0-9.0的范围内均表现比较稳定,且在pH 8.0附近表现十分稳定。在pH 5.0的孵育条件下,24 h后酶活有损失较大,残余50 %左右的酶活。5mmol/L的CaCl2的加入对SYBC Li-2脂肪酶的热稳定性有了一定改善,在60℃的孵育条件下,1 h后酶活可保留68%左右,对照的酶活下降到原酶活的43%。但是5mmol/L的CaCl2的加入对SYBC Li-2脂肪酶的pH稳定性几乎没有影响。在产酶发酵过程初始添加钙离子、镧离子和三氟拉嗪,发现钙离子对产酶酶活的影响作用都要大于其单纯对脂肪酶纯酶的激活作用,同时离子通道抑制剂镧离子和三氟拉嗪的加入不同程度抑制了产酶,说明钙离子不仅对脂肪酶活性具有激活作用,可能也对产酶发酵过程中脂肪酶的折叠分泌有一定影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 脂肪酶概述
• 1.1.1 脂肪酶的定义
• 1.1.2 脂肪酶的来源
• 1.1.3 微生物脂肪酶的应用
• 1.2 研究背景
• 1.2.1 产脂肪酶微生物的筛选
• 1.2.2 脂肪酶的酶活测定
• 1.2.3 脂肪酶的分离纯化
• 1.2.4 双水相萃取
• 1.2.5 提高微生物脂肪酶产量、活性和稳定性的方法研究
• 1.2.6 钙离子对微生物脂肪酶活性和稳定性的影响
• 1.2.7 钙离子对细菌脂肪酶的折叠分泌的影响
• 1.3 研究目的及内容
• 第二章 产脂肪酶微生物的筛选及鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验仪器和试剂
• 2.2.2 筛选材料
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 产脂肪酶微生物的筛选
• 2.2.5 脂肪酶酶活力的测定
• 2.2.6 菌种鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 产脂肪酶微生物的筛选
• 2.3.2 SYBC Li-2 菌株的鉴定
• 2.4 小结
• 第三章 双水相萃取分离纯化Acinetobacter sp. SYBC Li-2 脂肪酶
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 仪器和试剂
• 3.2.3 盐析范围的确定
• 3.2.4 透析和浓缩
• 3.2.5 双水相萃取
• 3.2.6 实验测定双结点曲线
• 3.2.7 脂肪酶酶活力的测定
• 3.2.8 发酵液蛋白含量的测定
• 3.2.9 数据分析
• 3.2.10 脂肪酶同工酶的测定
• 3.2.11 SDS-PAGE 电泳
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 硫酸铵沉淀
• 3.3.2 双水相萃取体系的确定
• 3.3.3 PEG 分子量对萃取效应的影响
• 3.3.4 PEG 浓度对萃取效应的影响
• 2PO₄ 浓度对萃取效应的影响'>3.3.5 KH₂PO₄浓度对萃取效应的影响
• 3.3.6 体系pH 对萃取效应的影响
• 3.3.7 NaCl 对萃取效应的影响
• 3.3.8 双水相萃取体系的正交优化
• 3.3.9 Acinetobacter sp. SYBC Li-2 脂肪酶分离纯化结果
• 3.4 小结
• 第四章 钙对Acinetobacter sp. SYBC Li-2脂肪酶酶学性质及发酵产酶的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验仪器和试剂
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 实验材料
• 4.2.4 菌体培养及胞外脂肪酶的获得
• 4.2.5 发酵菌体量测定方法
• 4.2.6 脂肪酶酶活力的测定
• 4.2.7 发酵液蛋白含量的测定
• 4.2.8 数据分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 钙对SYBC Li-2 脂肪酶活性的影响
• 4.3.2 SYBC Li-2 脂肪酶的热稳定性及钙对它的影响
• 4.3.3 SYBC Li-2 脂肪酶的pH 稳定性及钙对它的影响
• 4.3.4 SYBC Li-2 菌体的生长曲线和产酶曲线
• 4.3.5 钙对SYBC Li-2 发酵产脂肪酶的影响
• 4.4 小结
• 结论和展望
• 一、重要结论
• 二、存在问题和展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文