东北林蛙皮肤抗微生物肽真核表达体系构建与抗菌活性研究

论文摘要

抗微生物肽（Antimicrobial peptides,AMPs）作为生物体天然免疫屏障的先锋效应因子,可通过病原体诱导的免疫应答迅速合成,表现为广谱抗微生物活性,且两栖类皮肤中抗微生物肽的种类及数量最为丰富。本项目以东北地区两栖类代表物种东北林蛙（Rana dybowskii）为研究对象,构建其皮肤AMPs分泌型毕赤酵母表达系统,获得重组AMPs,进行抗菌活性鉴定,为筛选抗菌效果显著的新药候选分子以及探讨其作用机制奠定基础。方法:本实验采用PCR技术在重组pMD18-T质粒上扩增AMPs基因,在基因两端引入酶切位点,首次利用AMPs前体中天然EKR序列设计成熟肽AMPs表达程序,PCR产物经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,克隆入分泌型表达载体pPIC9K,PCR鉴定、DNA测序检测重组质粒,确定正确插入的重组真核表达载体。真核表达载体经LiCl转化和PEG1000转化导入毕赤酵母后涂于MD平板,挑取菌落,G418加压筛选多拷贝株,进行表型鉴定、PCR鉴定,确定获得正确插入的高拷贝重组酵母株。筛选优化重组酵母株培养条件,摇瓶培养,培养液经葡聚糖G-25层析脱盐、冻干,Bradford法检测重组AMPs含量,比浊法测定重组AMPs对标准质控G-大肠杆菌（E.coli）、G+金黄色葡萄球菌（Saureus）最低抑菌浓度（MIC）和协同效应。结果:（1）获得六种正确插入的重组真核分泌型表达载体pPIC9K-DB1、pPIC9K-DB2、pPIC9K-DB3、pPIC9K-CS1、pPIC9K-CS2、pPIC9K-AM3;并成功获得AMP-DB2、AMP-CS2、AMP-AM3三种重组分泌型毕赤酵母高拷贝株,分别为5、11、1株;重组酵母摇瓶培养最优条件为0.5%甲醇,诱导36h。（2）重组AMP-DB2、AMP-CS2、AMP-AM3对G+S.aureus的MIC分别为7.44、14.88、14.88（mg/ml）,而对Ecoli的MIC则分别为59.52、29.76、59.52（mg/ml）;AMP-DB2与AMP-CS2的组合对G-E.coli的MIC比单独作用时分别降低至75%和50%,但重组AMPs对G+S.aureus无明显协同作用。结论:本项目首次利用AMPs前体中天然EKR序列设计成熟肽AMPs表达载体,建立了东北林蛙皮肤成熟AMPs的分泌型毕赤酵母表达系统。并通过重组酵母诱导成功生成对G+和G-菌有抑杀作用的重组AMPs,对G-E.coli活性的抑制有明显协同作用。

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摘要

Abstract

缩略语表

1 绪论

1.1 抗微生物肽简介

1.1.1 抗微生物肽的结构及分类

1.1.2 抗微生物肽的作用机制

1.1.3 抗微生物肽的生物表达

1.2 两栖类抗微生物肽的种类、来源及组织学分布

1.3 抗微生物肽的人工制备

1.3.1 大肠杆菌表达系统

1.3.2 酵母表达系统

1.3.3 昆虫细胞表达系统

1.3.4 哺乳动物表达系统

1.3.5 其它表达体系

1.4 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 酵母菌株、质粒、原核菌株

2.1.2 工具酶、主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 构建抗微生物肽的毕赤酵母表达载体

2.2.1 设计引物

2.2.2 重组抗微生物肽基因的制备

2.2.3 双酶切重组抗微生物肽基因

2.2.4 连接与转化

2.3 转化毕赤酵母

2.3.1 重组质粒的大量提取和纯化

2.3.2 质粒的线性化

2.3.3 酵母感受态细胞的制备

2.3.4 转化酵母感受态细胞

2.3.5 阳性菌落的加压筛选和表型鉴定

2.4 抗微生物肽的表达与检测

2.4.1 阳性菌株的诱导表达

2.4.2 重组表达蛋白的纯化

2.4.3 重组表达蛋白的抑菌活性检测

3 结果

3.1 表达载体构建流程

3.2 PCR 扩增抗微生物肽基因

3.3 阳性重组 pPIC9K

3.4 阳性重组毕赤酵母菌株

3.5 重组酵母株表达条件的初步优化

3.6 重组表达蛋白的抑菌活性检测

4 讨论

4.1 蛋白表达系统的选择

4.2 表达载体的选择与构建策略

4.2.1 选择 pPIC9K

4.2.2 插入序列的选择

4.3 基因选择

4.4 重组酵母的转化与筛选鉴定

4.4.1 化学转化方法

4.4.2 表型筛选

4.4.3 G418加压筛选

4.5 重组酵母的诱导表达与纯化

-、G⁺菌不同抑杀作用'>4.6 对 G^-、G⁺菌不同抑杀作用

4.7 协同抑菌作用

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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