禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白的功能分析

论文摘要

由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的小麦赤霉病是一种世界性流行性真菌病害,造成粮食减产以及品质降低,并且导致麦粒中携带真菌毒素,从而威胁粮食安全和人畜健康。为找出防治赤霉病的有效方法,深入研究禾谷镰刀菌对小麦的致病机理是十分必要的。Rho族蛋白是Ras超家族蛋白的重要成员之一,作为GTP结合蛋白（GTP-binding protein）,参与多条信号转导途径,作为“分子开关”发挥桥梁作用。本实验通过生物信息学的方法,从禾谷镰刀数据库中同源比对获得与酿酒酵母中Rho4同源的蛋白,基因号为FG00304。运用基因敲除技术对该基因进行敲除,获得敲除突变体菌株。通过表型分析发现,与野生型禾谷镰刀菌PH-1相比,FgRHO4基因敲除突变体菌丝生长速度严重减慢,气生菌丝减少,产孢量显著降低,且分生孢子出现异常,菌丝和分生孢子的隔膜消失,无法进行正常的有性生殖,并且对小麦的致病性丧失。通过构建FG00304基因的互补载体,获得正确的互补菌株,表型分析显示敲除突变体的各种缺陷表型均得到恢复。通过同源比对,我们找到了两个假定的FgRho4GEF,通过对其中一个GEF（guanine nucleotide exchange factors,鸟苷酸交换因子）,FgBud3的基因敲除和表型分析,发现其具有和FgRho4相似的功能。综上所述,禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白参与调控菌丝的生长、产孢、隔膜形成、有性生殖以及侵染致病过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 小麦赤霉病和禾谷镰刀菌
• 1.1 小麦赤霉病
• 1.2 禾谷镰刀菌的形态学及其侵染循环
• 2 Rho族蛋白及其Rho蛋白的功能多样性
• 2.1 Rho族蛋白的结构
• 2.2 Rho蛋白的生物学功能
• 2.2.1 哺乳动物中Rho蛋白的功能研究
• 2.2.2 植物中Rho蛋白的功能研究
• 2.2.3 真菌中Rho蛋白的功能研究
• 3 禾谷镰刀苗Rho4同源蛋白功能研究的意义
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 常用培养基及配方
• 1.3 抗生素
• 1.4 生化试剂
• 2 实验方法
• 2.1 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白的生物信息学分析
• 2.1.1 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白序列的获得
• 2.1.2 八种真菌中Rho4蛋白序列的同源性比对
• 2.1.3 八种真菌中Rho4同源蛋白的系统进化关系分析
• 2.2 禾谷镰刀茵目的基因敲除载体的构建方法
• 2.2.1 引物设计与PCR扩增
• 2.2.2 DNA片段的回收
• 2.2.3 PCR产物的TA克隆
• 2.2.4 质粒的提取
• 2.2.5 质粒的酶切与连接
• 2.3 禾谷镰刀菌cDNA的制备
• 2.3.1 禾谷镰刀苗RNA的提取
• 2.3.2 逆转录RT-PCR
• 2.4 禾谷镰刀菌基因的敲除与互补
• 2.4.1 禾谷镰刀菌目的基因的敲除
• 2.4.1.1 禾谷镰刀菌基因敲除原理
• 2.4.1.2 禾谷镰刀菌目的基因敲除载体的构建
• 2.4.2 禾谷镰刀菌互补载体构建
• 2.4.3 FgRho4-GFP融合互补载体的构建
• 2.4.4 禾谷镰刀菌原生质体的制备和转化
• 2.4.5 转化子的鉴定
• 2.4.5.1 PCR扩增验证
• 2.4.5.2 Southern Blot
• 2.5 禾谷镰刀菌的表型分析
• 2.5.1 禾谷镰刀菌菌落生长速率测定
• 2.5.2 禾谷镰刀菌产孢量统计
• 2.5.3 禾谷镰刀菌孢子及菌丝形态观察
• 2.5.4 禾谷镰刀菌孢子萌发观察
• 2.5.5 禾谷镰刀菌有性交配的鉴定
• 2.5.6 小麦麦穗活体注射接种鉴定禾谷镰刀菌的致病性
• 第三章 结果与分析
• 1 生物信息学结果及分析
• 1.1 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白序列的获得
• 1.2 八种真菌中Rho4蛋白序列的同源性比对分析
• 1.3 八种真菌中Rho4 GTPase同源蛋白的系统进化关系
• 2 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白的功能分析
• 2.1 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白KO突变体和互补菌株的筛选与鉴定
• 2.1.1 PCR扩增初筛
• 2.1.2 RT-PCR（反转录PCR）验证
• 2.1.3 Southern blot验证
• 2.2 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白KO突变体的表型分析
• 2.2.1 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白KO突变体对菌丝生长的影响
• 2.2.2 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白KO突变体对分生孢子的影响
• 2.2.3 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白KO突变体影响隔膜的形成
• 2.2.4 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白KO突变体对有性生殖的影响
• 2.2.5 禾谷镰刀菌Rho4同源蛋白KO突变体对致病性的影响
• 2.3 禾谷镰刀菌Rho4互补菌株的筛选及表型分析
• 2.3.1 禾谷镰刀菌Rho4互补菌株的筛选
• 2.3.2 禾谷镰刀菌Rho4互补菌株的表型分析
• 2.4 禾谷镰刀菌Rho4蛋白在菌丝细胞中的定位观察
• 3 禾谷镰刀菌Rho4假定GEF--FgBud3同源蛋白的鉴定与表型分析
• 3.1 禾谷镰刀菌Bud3同源蛋白KO突变体的筛选与鉴定
• 3.1.1 PCR扩增初筛
• 3.1.2 Southern blot验证
• 3.2 禾谷镰刀菌BucB同源蛋白KO突变体的表型分析
• 第四章 小结
• 1 结论与讨论
• 2 后续工作
• 参考文献
• 附录
• 附表
• 致谢