恶臭假单胞菌D15和E19铁载体合成相关基因的克隆及功能初步分析

论文摘要

利用平板培养法,从棉花根际中分离出400多个细菌分离物,根据在CAS检测平板上形成显色圈的大小,从中筛选出铁载体合成能力较强的分离物E19。同样的方法,从花生根际中筛选出铁载体产生菌D15。通过形态观察、生理生化鉴定,E19和D15都是革兰氏阴性无芽孢杆菌,属于假单胞菌属,16S rDNA测序结果表明,两者的16S rDNA序列与Pseudomonas putida 16S rDNA序列同源性为100%。用抗生素梯度平板法,对Pseudomonas putida E19和D15进行药敏试验,E19和D15都对卡那霉素敏感,能够耐受50μg/mL以上的氯霉素。用转座子Tn5-1063分别对E19和D15进行转座子插入诱变,从E19的转座突变株中,筛选到22株铁载体合成缺失突变株,分别为:E1-19、E3-54、E4-69、E7-13、E7-66、E7-82、E7-85、E10-27、E10-76、E11-67、E12-38、E12-48、E13-3、E13-32、E13-56、E14-6、E14-38、E3-54、E4-50、E8-32、E8-87、E12-64。从D15的转座突变株中,筛选到1株铁载体合成缺失突变株D15-4。根据转座子Tn5-1063上的luxA序列设计引物,分别以E19和D15总DNA、pRL1063a质粒DNA和突变株总DNA进行PCR扩增,测序结果表明,铁载体合成缺失突变株中luxA序列与Tn5-1063的luxA序列同源性均为100%,由此证实,转座子插入到E19和D15的基因组中。根据转座子Tn5-1063两端的序列,分别设计3个嵌套引物,同时设计了7个随机引物,用TAIL-PCR（Thermal asymmetric inter laced PCR）方法,从突变株D15-4中克隆获得了转座子侧翼序列。采用TAIL-PCR与特异性PCR扩增相结合,克隆了P. putida D15铁载体合成相关基因簇cysPTWA。cysPTWA基因簇与细胞中硫酸盐吸收和代谢有关,而硫酸盐为半胱氨酸合成提供巯基。转座子插入到cysP和cysT基因间区域,由于极性效应,降低了其下游基因cysTWA的表达效率,影响了硫酸盐的吸收,半胱氨酸合成受阻,从而影响突变株铁载体的合成效率。用硫酸盐吸收实验对其功能进行了验证。从突变株E13-32中克隆到铁载体合成相关的psvA基因片断,在Pseudomonas entomophila str. L48中, psvA编码铁载体pyoverdine synthetase A,该基因与pyoverdine铁载体的合成直接相关。

论文目录

• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 铁的生物学功能
• 1.2 微生物铁载体的类型
• 1.3 微生物铁载体的应用价值
• 1.3.1 微生物铁载体与植物的作用
• 1.3.2 铁载体的抗癌、抗病毒、抗氧化作用
• 1.3.3 类酚氧化酶活性（纸浆的漂白）
• 1.3.4 环境修复
• 1.4 假单胞菌铁载体
• 1.5 微生物铁载体相关基因研究现状
• 1.5.1 enterobactin 的合成及相关基因
• 1.5.2 pyoverdine 的合成及相关基因
• 1.5.3 pyochelin 的合成及相关基因
• 1.6 铁载体研究方法
• 1.6.1 CAS 法
• 1.6.2 光吸收法
• 1.6.3 纸电泳法
• 1.6.4 薄层色谱法
• 1.6.5 高效液相色谱法
• 1.6.6 交叉培养法
• 1.7 转座子诱变法
• 1.8 本研究的目的意义
• 1.9 研究内容、技术路线及方法
• 1.9.1 研究内容
• 1.9.2 技术路线
• 1.9.3 主要研究方法
• 第二章 Pseudomonas putida D15 和 E19 分离鉴定及铁载体合成缺失突变株的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 培养基与培养液
• 2.2.3 主要药品、试剂
• 2.2.4 主要仪器、设备
• 2.2.5 根际细菌的分离
• 2.2.6 铁载体定性检测
• 2.2.7 铁载体产生菌抗药性检测
• 2.2.8 转座子诱变
• 2.2.9 基因组 DNA 的提取
• 2.2.10 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.11 DNA 凝胶回收
• 2.2.12 DNA 浓度的确定
• 2.2.13 生理生化鉴定
• 2.2.14 16S rDNA 扩增
• 2.2.15 PCR 产物的纯化
• 2.3 结果
• 2.3.1 棉花、花生根际细菌产铁载体菌的分离
• 2.3.2 铁载体产生菌D15 和E19 的抗药性试验
• 2.3.3 铁载体产生菌D15 和E19 的鉴定
• 2.3.4 铁载体合成缺失突变株的筛选
• 2.4 讨论
• 第三章 P. putida D15 铁载体合成相关基因簇 cysPTWA 的克隆及序列分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 培养基与培养液及试剂
• 3.2.3 TAIL-PCR
• 3.3 结果
• 3.3.1 转座子 Tn5-1063 右侧翼序列的获得
• 3.3.2 cysPTWA 基因簇序列克隆及分析
• 3.3.3 不同硫酸盐浓度下的突变株与野生型菌株生长情况
• 3.4 讨论
• 第四章 P.putida E19 铁载体合成相关基因 psvA 片断的克隆
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株与质粒
• 4.2.2 培养基与培养液及试剂
• 4.2.3 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 转座子 Tn5-1063 左侧翼序列的获得
• 4.3.2 psvA 基因部分序列的获得
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 尚待完成的工作
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士研究生在省级以上刊物上公开发表的论文目录