高脂饲养大鼠肾脏微血管病变与脂毒性的关系及其机制研究

论文摘要

目的:通过长期高脂饮食饲养的方法建立高脂肥胖大鼠模型;正常血糖高胰岛素钳夹实验评价其外周胰岛素抵抗水平;观察长期高脂饮食饲养后大鼠肾脏功能及结构的改变;探讨脂毒性对肾脏微血管病变的影响及吡格列酮干预的作用,为有效预防和治疗本病提供理论依据。方法:选用8周龄健康雄性SD大鼠45只,体重250g左右,适应性饲养1周后,按照随机数字表将大鼠随机分为正常对照组（NC）、高脂饲养组（HF）和高脂饲养+吡格列酮干预组（HP）,每组15只:NC组采用普通饲料喂养,脂肪占总热量的10%;HF组采用高脂饲料喂养,脂肪含量占总热量的66% ; HP组高脂喂养同时给予吡格列酮15mg·kg-1·d-1剂量灌胃。饲养满32周后将各组大鼠置于代谢笼中收集24小时尿,用于检测24小时尿白蛋白定量;采血检测各项血清学指标;行正常血糖高胰岛素钳夹实验后处死动物,迅速分离两侧肾脏,观察肾脏的颜色、质地,留左肾于4%的中性甲醛溶液,用于HE、PAS染色及血管内皮生长因子（VEGF）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）免疫组织化学染色,观察肾组织结构的改变和VEGF和ICAM-1的表达情况;右肾置于液氮,备检,用于实时荧光定量PCR法检测肾皮质VEGF和ICAM-1mRNA的表达;取腹腔、肾囊及睾丸等处脂肪称重,计为内脏脂肪重量,计算内脏脂肪重量占体重百分比。日本OlympusAU400全自动生化分析仪检测空腹血糖;放射免疫分析方法测定空腹血清胰岛素（fasting insulin,FINS）、24小时尿白蛋白定量;酶比色法测定甘油三酯（triglyceride ,TG）;酶法测定血清游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）。正常血糖高胰岛素钳夹实验评价其外周胰岛素抵抗水平,行颈静脉、颈动脉插管,体重恢复后,从颈静脉导管以微量泵输入短效胰岛素,速率12mU.min-1.kg-1,同时输注20%葡萄糖溶液。每10min从颈动脉导管取血测定血糖值,根据血糖值调整葡萄糖输注速度,使血糖稳定在5.0±0.2mmol/L,维持120min,计算葡萄糖输注率（GIR）。HE、PAS染色观察肾组织病理结构变化,SP法对肾组织标本进行VEGF和ICAM-1免疫组织化学染色,以DAB法显色,结果以IPP5.1图像分析系统进行半定量分析,比较肾小球平均光密度（肾小球着色面积IOD/肾小球总面积）。实时荧光定量PCR检测肾皮质VEGF及ICAM-1基因表达,用Trizol试剂一步法提取大鼠肾脏总RNA,ReverTra Ace-αcDNA试剂盒合成大鼠肾脏cDNA,采用ABI?PRISM 7300实时荧光定量PCR仪进行基因检测。内参照为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。引物均由上海生工生物公司合成。使用2-??CT方法计算基因表达情况。用SPSS10.0统计分析软件处理实验数据,所得数据符合正态分布的以x±s表示,偏态分布的变量数据以中位数表示,并经对数转换使之正态化后采用t检验及方差分析进行统计分析,若P<0.05或P<0.01,则认为两组数据差异有统计学意义。结果:1大鼠一般情况和特征:饲养至32周时,HF组和HP组大鼠体重、内脏脂肪重量及内脏脂肪占体重百分比均明显高于NC组（P均<0.01）。与NC相比,HF组空腹血糖、胰岛素、甘油三酯、游离脂肪酸、24小时尿白蛋白定量均明显升高（P<0.01或P<0.05）;HP组较HF组则有所改善,并且部分数值已接近NC组水平。2大鼠正常血糖高胰岛素钳夹实验结果比较:从60min开始各组大鼠血糖趋于稳定状态,HF组的葡萄糖输注率显著降低,稳定状态下平均葡萄糖输注率仅为（4.8±1.2）mg.min-1.kg-1,NC组稳定状态下平均葡萄糖输注率为（11.3±1.7）mg.min-1.kg-1,差别有显著意义（P <0.01）。HP组为（10.1±1.5）mg.min-1.kg-1与HF组比较明显改善（P <0.01）。3大鼠肾组织形态学改变:NC组大鼠肾小球结构未见明显异常;HF组出现肾小球病理改变,肾小球体积增大,PAS红染区明显扩大,肾小球毛细血管袢略显僵硬,系膜基质增生;HP组肾小球体积、PAS红染区及系膜基质增生均轻于HF组。4肾皮质VEGF及ICAM-1蛋白的表达:NC组大鼠肾小球中VEGF及ICAM-1基本不表达或弱表达,平均光密度分别为（0.0127、0.0145）;HF组大鼠VEGF、ICAM-1在肾小球内沿毛细血管壁及系膜区呈线状表达,较NC组明显增高（0.0797、0.0653,P均<0.01）;HP组肾小球VEGF、ICAM-1平均光密度分别为（0.0301、0.0148）,但仍略高于NC组（P均<0.05）。5实时荧光定量PCR检测大鼠肾脏基因表达:与NC组相比,HF组VEGFmRNA表达升高21%（P<0.01）,ICAM-1mRNA表达升43%（P<0.01） ;经吡格列酮干预后, HP组VEGF及ICAM-1mRNA表达较NC组均下降,分别为30%和15%（P均<0.01）。结论:1通过长期高脂饮食诱导可以成功制备高脂肥胖大鼠模型,具有胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、糖代谢紊乱等特征。2长期高脂饲养可导致大鼠肾脏微血管病变,引起24小时尿白蛋白定量增加,可能与高游离脂肪酸导致的肾皮质VEGF和ICAM-1的表达增加有关。3吡格列酮干预能明显改善大鼠肾脏微血管病变及尿白蛋白,并下调VEGF和ICAM-1的表达,对高脂所致的肾脏微血管病变起到一定的预防和治疗作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 高脂饲养大鼠肾脏微血管病变与脂毒性的关系及其机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述一 活性氧簇介导的信号转导通路与糖尿病肾病
• 综述二 胰岛素抵抗相关性肾病的研究进展
• 致谢
• 个人简历