经前平颗粒对愤怒情绪反应大鼠模型γ-氨基丁酸B2受体表达的影响及真核表达载体的构建

论文摘要

目的:研究愤怒情绪反应模型大鼠顶区皮层、额区皮层、海马和下丘脑中γ-氨基丁酸B2受体（GABABR2）mRNA及蛋白表达变化及经前平颗粒对其表达水平的调节作用,探讨愤怒反应的发生和致病机理以及经前平颗粒对愤怒反应调节的微观作用机制,并构建GABABR2真核表达质粒,为GABABR2转染神经元细胞提供物质基础,同时为研究其下游信号通路做铺垫。方法:1、居住-入侵配合社会隔离慢性应激法制备愤怒情绪反应大鼠模型,调肝方药经前平颗粒进行药物干预,并作行为学评价,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）基因扩增技术和蛋白免疫印迹技术（Western blot）分别检测大鼠顶区皮层、额区皮层、海马和下丘脑四个脑区GABABR2 mRNA和蛋白的表达水平。2、RT-PCR法扩增GABABR2 cDNA,克隆入载体PMD18-T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1-His-lacZ中,构建pcDNA3.1-His-lacZ -GABABR2重组表达质粒,然后用限制性内切酶和DNA测序鉴定。结果:1、大鼠造模行为学评价结果显示,与正常组大鼠相比,愤怒组大鼠均呈显著性差异（P<0.05）,给药后较正常对照组无显著差异。RT-PCR结果显示,与正常组相比,GABABR2 mRNA相对水平在愤怒组大鼠4个脑区均极显著性下降（P<0.01）;与模型组相比,愤怒给药组均发生极显著性改善（P<0.01）,除额区皮层外均与正常组无统计学差异。Western blot结果显示,与正常组相比,GABABR2蛋白相对水平在愤怒组大鼠4个脑区均极显著性下降（P<0.01）;与模型组相比,愤怒给药组均发生显著性改善（P<0.05）,与正常组无统计性差异。2、经测序鉴定GABABR2 cDNA序列正确,并经酶切和DNA测序证实pcDNA3.1-His-lacZ -GABABR2重组质粒构建正确。结论:采用居住-入侵造模法可以成功制备愤怒情绪反应大鼠模型,愤怒反应的发生和致病可能与顶区皮层、额区皮层、海马和下丘脑组织中GABABR2表达异常密切相关,成功克隆GABABR2 cDNA,并成功构建pcDNA3.1-His-lacZ -GABABR2重组真核表达质粒。

论文目录

• 提要
• Abstract
• 引言
• BR2 表达的影响'>第一部分 经前平颗粒对愤怒情绪反应大鼠模型GABA_BR2 表达的影响
• BR2 mRNA 表达的影响'>实验一 经前平颗粒对愤怒情绪反应大鼠模型GABA_BR2 mRNA 表达的影响
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 药品及试剂
• 1.3 仪器及器材
• 2 方法
• 2.1 大鼠模型制备
• 2.2 给药方法
• 2.3 居住入侵实验操作
• 2.4 造模后行为学评价
• 2.5 大鼠脑组织总RNA 的提取
• 2.6 RT-PCR
• 3 数据处理
• 结果
• 1 大鼠造模后行为学评价
• 1.1 混合攻击行为得分
• 1.2 糖水偏好结果
• 1.3 旷场实验结果
• BR2 mRNA 的表达结果'>2 大鼠不同脑区GABA_BR2 mRNA 的表达结果
• BR2 蛋白表达的影响'>实验二 经前平颗粒对愤怒情绪反应大鼠模型GABA_BR2 蛋白表达的影响
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 药品与试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 大鼠模型制备
• 2.2 蛋白的提取和测定
• 2.3 蛋白免疫印记（Western bolt）
• 3 数据处理
• 结果
• 讨论
• 1 怒致病的相关机理
• 1.1 怒的概念内涵和分型
• 1.2 致怒条件
• 1.3 怒产生的机理
• 1.4 怒致病的机理
• 1.5 怒所致情志病证
• 2 调肝方药经前平颗粒对愤怒情绪的调节作用
• 3 愤怒情绪反应大鼠模型的造模及评价
• 3.1 动物模型制作
• 3.2 模型评价
• 3.3 模型结果分析
• BR2 与情绪调控'>4 GABA_BR2 与情绪调控
• 5 问题与展望
• BR2 基因克隆及真核表达载体的构建'>第二部分 GABA_BR2 基因克隆及真核表达载体的构建
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 实验仪器
• 1.3 动物
• 1.4 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 总RNA 的提取
• 2.2 RT- PCR
• 2.3 目的片段回收
• 2.4 目的片段与克隆载体连接
• 2.5 制备感受态细胞
• 2.6 大肠杆菌细胞的转化
• 2.7 质粒DNA 的提取
• 2.8 重组T 载体双酶切
• 2.9 真核表达载体的构建
• 结果
• BR2 cDNA 的RT-PCR 电泳结果'>1 GABA_BR2 cDNA 的RT-PCR 电泳结果
• 2 含目的基因的条带电泳结果
• 3 重组真核表达质粒酶切电泳结果
• 4 测序结果及比对
• 讨论
• 1 真核表达载体构建相关问题
• 1.1 基因表达载体概述
• 1.2 目的基因和载体结合
• 1.3 GABABR2 真核表达载体构建
• BR2 的结构和功能'>2 GABA_BR2 的结构和功能
• B 受体的细胞信号传导通路'>3 GABA_B受体的细胞信号传导通路
• 3.1 与G 蛋白偶联影响离子通道
• 3.2 与G 蛋白偶联影响腺苷酸环化酶（AC）系统
• 3.3 直接作用于转录因子
• 3.4 其他
• 4 问题与展望
• 结语
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录：缩写词表
• 致谢
• 论文著作
• 详细摘要